【精品】药学本科分子生物学实验指导

1、实验项目一：总rna的提取(必做)一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总rna的捉取和分析方法。三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用trilzol试剂盒抽提rna去除蛋白质和 dnao四、实验耍求学会提取基因组rna的方法和操作过程提取rna吋，要特别注意防止rnase的污染，所用玻璃器皿均应 用 0.1%的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate, depc)处理。 塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用 0. 1%depc 处理。五、实验所需仪器设备移液器及吸头，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液枪 等六、实验原理trizol试剂适用于

2、从细胞和组织中快速分离rnao最大特点是可 同时分离一个样品的rnadna蛋白质.trizol使样品匀浆化，细胞裂 解，溶解细胞内含物，同时因含有rnase抑制剂可保持rna的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，rna在水相中。取出水 相用异丙醇沉淀可冋收rna；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddh20冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4冷冻离心机冷却到4°c （预冷半个小时）。准备冰盒。5. 戴口罩，戴手套。6. 每个ep管中,加入loomg左右的组织，加入iml trizol试 剂，7.

3、 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。9. 加入200ul氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5 分钟。10. 离心:4°c, 13, ooorpm, lomin。11. 取新ep管。将上层水相（约600ul）加入新ep管，12. 再加入500ul异丙醇，室温静置10分钟。13.离心：4°c, 13, ooorpm, lomirio解 rna。15-70度保存提取的总r7a。八、注意事项1. rna酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源rna酶外，外界环境中均存在rna酶,所以操作吋应戴手套。2. rna提取用品准备:1）普通的玻璃器皿:1

4、80°c烘干8小时（玻璃），研钵，小勺， 试剂瓶若干个。2）一次性使用的塑料制晶：枪头、ep管等先用depc水处理然 后高压灭菌，烘干。3）用烘烤过的药勺称取试剂。4）用depc水配制试剂：0. 1%depc水：37°c至少处理12小时,高压灭菌15mino实验结果:成功从植物中分离得到总rna实验项目二：总rna的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总rna的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法三、实验内容1、通过选择性沉淀rna分子去除dnao2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总rna四、实验要求1、学会纯化植物总rna的方法2、学会定量、定性检测rna的方法

5、五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机， 恒温水浴锅，微量移液枪，微波炉或电炉，紫外透射仪，照相机、 紫外分光光度计六、实验原理乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。 在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使rna沉淀。 反复利用乙醇沉淀rna,可以起到纯化rna的作用。由于细胞中70-80%的rna为rrna,总rna电泳后uv下应能看到 非常明显的rrna条带。动物rrna大小分别约为5kb和2kb,分别相 当于28s和18s rrna；植物叶片屮由于含有大量的叶绿体rna,可见 4条或更多rrna；细菌rrna大小分别约为4k

6、b和2kb,分别相当于 细菌23s和16s rrnao rna样品中最大rrna亮度应为次大rrna亮度 的1. 5-2. 0倍，否则表示rna样品的降解。出现弥散片状或条带消失 表明样品严重降解。0d260/0d280比值是衡量rna样品中蛋白质污染程度的指标。高 质量的 rna 样品，0d260/0d280 值(lommtyis, ph7. 5)在 2.0 左右。 0d260/0d280读数受测定所用溶液的ph值影响。同一个rna样品， 假定在10mm tris, ph7. 5溶液中测出的od260/od280读数在1.8-2. 1 之间，在水溶液中所测读数则可能在15-1. 9之间，但这

7、并不表示 rna不纯。取一定量的rna提取物，用rnase-free水稀释n倍，用 rnasc-frcc水将分光光度计调零，取稀释液进行0d260测定，按照 以下公式进行rna浓度的计算：终浓度(ng/p 1) =od260x n (稀释倍数)x 40七、实验步骤(-)总rna的纯化1. 提取的总rna,加入75%乙醇500ul洗涤。2. 离心：4°c, 7, 500rpm, 5mino3. 去上清液，加入无水乙醇500ul洗涤。4 离心：4°c, 7,500rpm, 5mino5. 去上清液，空气干燥5-10分钟。(rna不可以完全干燥，防i上复溶的吋候困难)6. 加入

8、20-30 ul depc 水，55°c10min,以完全溶解 rna。（二）总r7a质量的检测（完整性的检测）1. 称取琼脂糖0. 25 g,溶于盛有30ml的50xtae （电泳缓冲 液）的锥形瓶中；母液为50xtae: 242 g tris碱+ 57. 1 ml冰醋 酸 + 37. 2 g na2edta 2h2o 配成 1l 于 4 °c储备）,2. 将上述液体置于微波炉屮火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化 为准）；加热时应盖上盖子，以减少水份蒸发。3. 在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清 洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4. 从微波炉中取出已经完

9、全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用 吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；5. 向锥形瓶中加入10 mg/ml的漠化乙锭（eb） 1 m （终浓度 0.5 lg/ml, eb插入dna双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种 在紫外光下发光的络合物，容易观察），轻轻地旋转以充分混匀凝胶 溶液；6. 将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的 温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气 泡。如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成 加样孔。梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 1.0 mm,这样琼脂糖 浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7. 让

10、凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳了，注意不要损伤梳底部的凝胶。8. 将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 ' tae）, 要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进 入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。9. 在干净的一次性手套上混合rna样品和6 '上样缓冲液（5 m样品混合1 m 6 '上样缓冲液）；10. 用枪将样品混合液缓慢加入点样孔内；每加完一个样品要更 换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或 将样品槽底部凝胶刺穿。 并加入4ul的dna marke

11、r,作为标记。11. 接好电极插头。出孔电压为100 v （约2min）；出孔以后电 压用70 v,电流在40ma以上；电泳30分钟左右，当澳酚蓝条带移 动到距凝胶前沿约2cni时，停止电泳，关上电源。注意dna或rna的 泳动方向，防止反方向泳动而跳海。12观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察电泳胶板。rna 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防 护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。电泳可见明显两条带，rna 样品中最大rrna亮度应为次大rrna亮度的1. 5-2. 0倍，说明抽提的 rna质量高。常用电泳缓冲液制备：1xtae:40mm tris-乙酸 i

12、mm edta1xtpe:90mm tris-磷酸 2mm edta 0. 5xtbe: 45mm tris-硼酸 imm edta凝胶加样缓冲液：0. 25%漠酚蓝 0.25%二甲苯青ff40%蔗糖或（15%聚蔗糖400 30%廿油）（三）rna浓度与纯度的检查1. 取样本r7a 1 m加99 m depc处理水（稀释100倍）；2. 准备一管depc处理水以调零；3. 开仪器后部的开关；4. 按“rna”键即为检测rna；5. 取比色iii.一个，用depc处理水洗一遍；6. 加depc处理水到比色皿后将比色皿放置在仪器指定位置，按 "blank"键 调零（放比色皿时注

13、意光面和毛面；手接触毛面，光线透过的应该是光面）；7. 取出比色皿，吸干前液；8吸样品液到比色皿的凹槽内，将比色皿放置在仪器指定位置, 按"sample"键后记录下仪器显示的样品浓度和a260/a280值（其 比值可以判断核酸样品的浓度，对于dna样品比值应在1.6-1.8z间, 小于16有蛋口质的污染，大于1.8有rna污染对于rna比值应在 2.0以上，如果小于2.0表示蛋白质或苯酚的污染。）9. 实验结束后将比色皿洗干净备用。10. 以下公式进行rna浓度的计算：终浓度（ng/ul） =od260xn （稀释倍数）x40八、注意事项1. rna纯化吋动作轻柔，防止rn

14、a分子断裂2. 防止rna酶水解rna3. 乙醇沉淀rna时，不可完全干燥，否则不可以rna难以复溶4. 由于细胞屮70-80%的rna为rrna,电泳后uv下应能看到非 常明显的rrna条带。动物rrna大小分别约为5kb和2kb,分别相当 于28s和18s rrna；植物叶片中由于含有大量的叶绿体rna,可见4 条或更多rrna；细菌rrna大小分别约为4kb和2kb,分别相当于细 菌23s和16s rrnao rna样品屮最大rrna亮度应为次大rrna亮度的 1.5-2. 0倍，否则表示rna样品的降解。岀现弥散片状或条带消失表 明样品严重降解。5. 不同组织或细胞中提取rna预期得率

15、植物叶片100-200 ug/g 叶片动物组织200-400 ug/g肝脏组织动植物培养细胞5-10 ug/106细胞革兰氏阴性细菌2-10 ug/ml dh5a 过夜菌血液3 5 u g/ml人全血实验结果:电泳可见明显两条带，rna样品中最大rrna亮度应为次大rrna 亮度的1. 5-2. 0倍，说明抽提的rna质量高。并且紫外分光光度法测得的rna的浓度和纯度复合实验预期，可以进行下一步的rt-pcr的实验。实验项目三：pcr基因扩增一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习pcr反应的基木原理与实验技术。三、实验内容pcr反应四、实验要求正确操作pcr仪器，学会做一般pcr反应。

16、五、实验所需仪器设备移液器及吸头，硅烷化的pcr小管，dna扩增仪，台式高速离心机，pcr仪六、实验原理提取组织或细胞中的总rna,以其中的mrna作为模板，采用oligo(dt)作引物利用逆转录酶反转录成cdna。再以cdna为模板进行pcr 扩增，获得目的基因或检测基因表达。rt-pcr使rna检测的灵敏性 提高了几个数量级，使一些极为微量rna样品分析成为可能。该技术 主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cdna探针等。七、实验步骤()rna反转录产生cdna(均使用25ul的反应体系，使用大鼠gapdh(甘油醛-3-脱氢酶)做引物)1. oligdt illrna总量2ug（

17、根据测的样品浓度）depc h20 （15-oligdt-rna）轻弹几下后离心，总体积共15"。2. 72°c变性lomin ,迅速置冰上。（可以在pcr仪上设定相应的程序）3. 一次加入下列试剂：混匀，短时离心。25ul体系50ul体系5xmm lvrtbuffer5ullouldntp (25mm/each)5ulloulrnaseinhibition(40u/ml)0. 6ul1.2ulm-mlv-rt （逆转录酶）lul2ul说明：rna酶抑制剂和逆转录酶在加样前从-20°c冰箱取出所用的pcr管和吸取rna所用的枪头都是depc水处理的，余用消毒的 就

18、可！4. 42°c 60min 95°c3min 4°c 进行逆转录.（可以在 pcr 上设定相应的程序）（二）pcr1备一套新pcr反应管，按顺序加入以下物质50ul 体系(ul)25ul 体系(ul)无菌水35. 7517. 87510xtaq buffer with mg2+52.5dntp (25mm/each)42引物110.5引物210.5cdna31.5taq酶0.250.25说明：taq酶加样前取出.cdna用后存于-70°c冰箱.用tae稀释引物10倍稀释为储存液，再5倍稀释为工作液。2. 加完样后混匀，稍离心再加入15ul/管 矿物油

19、（mineral oil）,封闭，防止液体挥发。3. regular pcr （约 1. 5h）95°c2mino94°c30s,62°c30s , 72°clmin。（共 35 个循环）72°c 15min, 4°co八、注意事项1该实验使用的样品为rna,因此在反转录过程中，要特别注 意防止rna酶的污染。2. 取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起气泡。分取之前 要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。3. 为防止rna分解，应避免多次冻融，应将rna少量分装后保 存于-70 °c中。九、实验结果成

20、功从细胞总rna中利用rt-pcr技术，扩增出目的基因。实验项目三：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的方法。三、实验内容琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物四、实验要求正确操作使用琼脂糖凝胶电泳检测rna的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，硅烷化的pcr小管，台式高速离心机，pcr仪,琼脂糖，te、水平电泳仪、eb六、实验原理完全变性的条件下,rna的泳动率与分子量的对数呈线性关系。使用一定分子量的marker作为标记，就可以检测出样品rna的碱基 对数，从而判断检测样品中是否含有pcr扩增产物。通过光密度值与 对应内参基因条带的光密

21、度值的比值，可作为该基因的相对转录量进 行半定量分析。七、实验步骤1.称取琼脂糖025 g,溶于盛有30ml的50xtae （电泳缓冲 液）的锥形瓶屮；母液为50xtae: 242 g tris碱+ 57. 1 ml冰醋 酸 + 37. 2 g na2edta 2h20 配成 1l 于 4 °c储备）,2将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化 为准）；加热时应盖上盖子，以减少水份蒸发。3. 在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清 洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4. 从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用 吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的

22、两边封住；5. 向锥形瓶中加入10 mg/ml的澳化乙锭（eb） 1 m （终浓度0.5eb插入dna双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察），轻轻地旋转以充分混匀凝胶 溶液；6. 将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶吋的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气 泡。如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成 加样孔。梳齿的位置应在电泳板底面以上0.51.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7. 让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿 拔起；待胶完全凝固后拨出梳子，注意不耍损伤梳底部的凝胶。8. 将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 ' tae）, 要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进 入样品槽中,所以要注