液质联用操作规程

1、肀 For pers onal use only in study莀第1页共8页and research; not for commercialuse螈蚄液质联用仪操作规程蕿SOP I- Xevo-TQS薈 FSIDC蚅1 .适用范围螃本设备配备ACQUITY UPL液相色谱仪、TQS MS/MS质谱仪，适用于食品、药 品中各种有机物的定性、定量分析，是一种具有高灵敏度的检测仪器，仪器由主 机、计算机和数据处理软件等组成。羈2.职责芈2.1操作人员按照本规程操作仪器，认真填写实验使用记录蒃2.2保管人员负责对仪器进行定期维护和保养。袁2.3科室负责人负责监督检查规程的执行。莈3.操作程序螅日常

2、操作步骤：薄准备UPLC->设置样品表一-> 运行样品一-定量一-打印报告。罿注：如果一个星期内不运行样品请不要关质谱仪，使其保持真空。螇建立新方法和project的操作步骤：蒅准备UPLC建立新的project 用标准品调谐编辑质谱方法编辑 UPLC方法一-设置样品表一-运行样品一-定量一-> 打印报告。蚅 3.1 开机：莂 3.1.1 彻底开机顺序（仪器已关闭）蒁确定 MS 及其它仪器电源电缆已连接 ，开氮气发生器、开氩气，小表 <0.1mpa。芅打开计算机电源 > 等待 windows 正常启动 >电脑界面右下角网络图标红叉。蒃打开UPLC自动进样器电

3、源，等到电脑界面右下角网络图标出现感叹号！。蒀打开UPLC泵电源，等约30s或者是有响声。羀打开质谱电源，等待5min,离子源透视镜里面亮。羆打开Masslynx软件，masslynx主界面左侧instrument-Mass tune-界面菜 单栏 vacuum-pump 同样界面左侧偏上 diagnostics-vacuum-analyser MS1 turbo speed%要在5分钟内升到80。至少抽真空4个小时 > 查看真空状态主界面 massconsole- 面左侧 xevo tq ms detector力卩号展开-ms display > 碰撞室真空度 >达蒄液质联

4、用仪操作规程袃第2页共8页荿SOP I- Xevo-TQS螆 FSIDC薆至U 7.x e-5mbar。羁3.1.2日常开机顺序（仪器未关闭）蝿开氮气发生器、开氩气，小表<0.1mpa,打开Masslynx软件，进入工作站。蒇3.2建立项目莃点击file下的project wizard ，出现对话框，单击yes出现对话框，输入 project ,location 为 C:MS DATA单击 next ,选择 create existing project as template, 并以 c:masslynx' 为模板，单击 finish .点击 OK。芃3.

5、3准备UPLC系统膈准备液相的一般流程：准备流动相 >准备样品>灌注二元泵> 灌注自动进样器 > 建立液相方法 > 平衡液相腿3.3.1.准备流动相10mM。莄用0.22um的膜过滤缓冲液，所有的缓冲液和超纯水都要新配制，超纯水和缓冲液使用不得超过二天，缓冲盐一定要是可挥发的，而且浓度不要大于蒂3.3.2.样品要求蚇所有样品都要用流动相初始梯度比例的溶剂来溶解，并用0.22um的膜过滤。羇3.3.3灌注二元泵蒆在Masslynx主界面，单击MS Console进入UPLC交互显示界面，点击左栏Acquity UPLC System> Control >

6、 Start Up System单击QSM，选择需要用到的流动相位置， 如A和B，选择seal wash,时间设为3分钟。薀单击 SM，选择 Strong Wash 5 cycles , Sample syringe 20莁单击Equilibrate to Method，将流速设为0 ,单击Start开始灌注.时间大约为 9min左右。蚈设定流速，平衡液相芃在Masslynx主界面，单击Inlet Method图标，打开液相方法编辑窗口，单击 status > ACQUITY Additional Status进入液相控制台，单击A或B或流速的位置， 出现流速、比例设定对话框，设定液相流

7、速与比例，单击对勾，开始平衡液相，如 果后面要做调谐，可设定流速 0.2ml/min,有机相与水相的比例为50:50。袂液质联用仪操作规程螀第3页共8页蒈SOP I- Xevo-TQS芄 FSIDC肁3.4准备质谱膀 3.4.1. 计算化合物单同位素质量数袄Masslynx主界面 > 单击ToolsMolecular Weight Calculator,输入化合物的分子式（大写-注意C、Br等正确的输入方法）,注意选单同位素Mono iso ,lo n Mode:离子 化模式， +ve 正离子， -ve 负离子 ,单击 Calculate。莆 3.4.2 用 Intellistart 进

8、行自动调谐莃在Masslynx主界面单击MS Tune图标，打开调谐窗口，单击 lon Mode> ES+ 或 ES- ，单击 APl Gas 图标打开氮气， 单击 打开高压蕿选择 MS Mode 图标 ，设定液相流速 0.2ml/min, 水：乙腈的比例为 50:50。蚅把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处的 A（或B或C）号位（注:浓度在200ppb 左右 ）膃单击Fluidics选择Reservoir为A ,Flow State为LC模式，点击 Purge图标。蒂 Purge 结束后，将 Flow State 改为 Combine 模式，设定 Function 为 MS1 scan

9、，Mass为计算出化合物的质量数，span为5，点击进样，开始进样，直到离子的 响应比较稳定。保存调谐文件：File > Save A至已建的项目下。肇在 Masslynx主界面，选择 Ms Console> Xevo TQ MS Detector莅选择 lntellistart ，选择 Sample Tune and Develop Method ， ES+芄单击 Start 图标 ，出现 lntellistart 自动调谐编辑窗口，选择 Switch to Advanced 薀 mode ，输入 Compound name （化合物名称 ） ， Molecular Mass/F

10、ormula （分子量 或分子式)Adduct A+ ( M+H+, 选择 Load Existing Sample Tune ,在 Sample Tune Name方框后的“。”处调用开始保存的调谐文件，在Develop MRM Method 前的方框打钩，并在方框出输入 MRM方法的文件名，路径为已建的项目下。在Print Report 前方框打钩，Cone Voltage，Collision Energy 处为默认值，Fluidics 下 的 Flow Path 选择 Combined 模式，Sample Reservoir 和 Sample Flow Rate参数与 Fuldics下C

11、ombined模式下的进样参数保持一致。单击右边的Start开始自动调 谐。调谐成功，会有绿勾出现 ，查看intellistart报告蒈膆液质联用仪操作规程芆第4页共8页羂SOP I- Xevo-TQS袇 FSIDC祎肃3.4.3 查看intellistart中自动生成的质谱方法：肁从MassLynx主窗口，单击 MS Method，出现MS Method编辑对话框,选择File > open,选择Intellistart中保存的质谱方法的文件，双击方法，如发现自动调谐 生产的质谱方法中部分参数有误，则可以在Cha nn els窗口手动修改参数，填写relentinon window中的

12、end时间，此时间必须与液相色谱方法运行时间保持一 致，选择Auto Dwell,单击OK，点击File> Save As,保存质谱方法文件。薀3.5建立液相方法蚆3.5.1编辑液相方法 膅在液相方法编辑窗口，单击Inle t，输入溶剂名称，run time及梯度洗脱程序，梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与 run time符合，单击0K,选择File > Save As 保存方法，单击Load Method，平衡液相。蒃3.5.2建立样品列表羀在Masslynx主窗口，选择 File > New建立一个空白的表samplelist。输入文件 名File Name，样品信息Fi

13、le Text，双击 MS File，选择质谱方法，双击Inlet File, 选择液相方法，在Bottle中输入样品瓶的位置，在Inject Volume中输入进样 体积，可右键> Add,增加样品表的行数，保存样品表：File > Save As。莇3.6数据采集和处理羂3.6.1.选中要采集的样品，单击Run > Start选择Acquire Sample Data only”单击 OK开始进样并采集。薁3.6.2在采集过程中，可查看色谱图，点击 Chromatogram窗口，点击Real-time葿Update icon .如果不能见整个 TIC图，单击 Defaul

14、t Range图标。腿如果方法中包括多个通道，可通过 Display > Mass查看羃如果方法中包括多个检测器或多个 Function,可通过Display > TIC查看蚀3.6.3处理多个Function的数据衿如果质谱方法中有多个 Function，如有三个Function，如想看第二个 Function， MS Sca n的数据。袈液质联用仪操作规程肅第5页共8页肂SOP I- Xevo-TQS芈 FSIDC薈363.1在色谱图窗口，点击 Display > TIC选中MS Sean，选择 Add trace，单 击OK。袂363.2如想查第二个Function.

15、Daughter Scan质谱图，在色谱图中，选择 Display > TIC,选择 ScanWaveDS Add trace，单击 OK。賺363.3.选择Process > Combine spectra分别用右键输入信号和本底噪音.单 击 OK.得到 Daughter Scan的质谱图，单击 Process > Smooth ，单击 OK。螇3.7数据处理-外标定量法莈3.7.1在Masslynx主页面单击Targetlynx/Edit method，出现定量方法编辑对话框，袃单击新建方法图标，新建一个定量方法。薃3.7.2单击Add new compound添加新的化

16、合物）图标，添加一个新的化合物。莁3.7.3 单击菜单栏 update,选中 Quantitation Ion 和 Compound Name （前面打勾）袅在Masslynx主页面，打开中等偏下低浓度标准品的色谱图，Display/Masschromatogram选出要定量的化合物的离子对，一般强度高的化合物用来做为定量 离子，另一个离子对则作为确证离子，用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下， 贝U compound name, Acquisition Function Number, Quantification Trace, Predicted Retention Time和Retent

17、ion Time window 将自动输入到定量方法中。注意：在色谱图上拉的时候，要遵循两个原则，拉的位置要以色谱峰的峰尖左右对称，拉的宽度要超过峰的起点和终点。羅3.7.4单击工作曲线图标，在工作曲线设置页面，填入蚁 Concen trati on Un its:浓度单位，例女口 n g/ml, ug/kg， ppb, ppm 等。袀Concentration of Standard: Level选择 Conc.A薅Poly nomial Type -选择Lin ear.（可根据自己行业的规定）螂Calibration Origin_选择exclude排除原点），include（包含原点），

18、force（强制过原点）螀Weithti ng Fu nctio n（权重）_1/x （根据自己行业规定）艿Propagate Calibratio n Parameters如果所有的化合物均用相同的工作曲线的参数，选Yes芅袄液质联用仪操作规程膂第6页共8页虿SOP I- Xevo-TQS肆 FSIDC芀3.7.5打开积分参数列表，选中 Apex Track Enabled （打勾，YES，IntegrationWindow Extent 输入 2，选中 Propagate Integration Parameters 打勾），如果色谱峰并不是很对称的色谱图，可先在色谱图上先设定参数，积分，

19、好积分参数满意之后，process/integrate/copy，在 Targetlynx 方法中 Edit/Past 就可将其粘贴到 Targetlynx 方法中。建议用 Apex Track 积分方法， Smooth 方法建议用 smooth iteration 1,smooth width 2 。重复上面的过程， 把其他几个化合物的信息全部加入 ，膈保存方法：File/Save As,保存到当前项目的 MethDB文件夹中，正确的samplelist 表格模板， 除了前面进样时的选项之外， 还要有 sample type, ConA, 等选中要处理 的样品，单击Process Sampl

20、es出现下图的对话框，确保选中，lntegrate、sample ， calibrate Standard, Quantify Sample选择刚才编辑的 Targetlynx 方法，单击 OK后， 出现定量结果对话框。可根据自己的需要，用鼠标右键， Chang Column Order 来 增加或减少Summary中的选项。螆 3.8 关机程序蚂3.8.1 日常关机：蚃如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水，灌注2 分钟，流速设为0.2ml/min ， 80%水相，冲洗至少 30 分钟，换成 80%有机相，冲洗至少 20分钟， 停流速，水相，冲洗至少 30 分钟，换成 80%

21、有机相，冲洗至少 20 分钟，停流速， 柱温为室温。薈关质谱：主界面mass tune或者电脑下面仪器图标-界面左侧偏上 fluidics-flow state选择为waste、关氩气，mass tune界面或者电脑下面仪器图标 工具栏第6个 关高压mass tune界面右下角 等待去溶剂气温度降低至100度以 下mass tune界面或者电脑下面仪器图标左侧偏上。ES+sourcetemperature-desolvation 关氮气 ，点击氮气发生器开启开关。薇螄3.8.2彻底关机螁先完成日常关机芁液质联用仪操作规程芇第7页共8页螅SOP I- Xevo-TQS

22、袀 FSIDC蚀肇泄真空：tune page > vacuum > vent-yes >等待涡轮分子泵转速降到 10以 下 ，masslynx主界面左侧instrument-Mass tune-界面左侧偏上 diag no stics-vacuum-source turbo speed%退出软件，其他界面先退出，主界面最后退出3.824关质谱电源 > 关所有UPLC电源，计算机电源，仪器三个电源顺序无所 谓，关氮气发生器，氩气。如果有UPS关闭UPS电源，计算机电源。4日常维护、保养及注意事项4.1仪器室要保持整洁、干净、无尘；

23、配套设施布局合理。4.2仪器室温度应相对稳定，一般应控制在 20-25 C,保持恒温；相对湿度最好 为50-70%,室内应备有温度计和湿度计，一般采用空调和吸湿机调节温度和湿度。4.3气压过滤机械泵油，停止样品采集、停止流动相、关闭高压、关闭所有气流， 关闭离子源内的真空隔离阀。用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上的GasBallast阀四分之一圈，运行30分钟后再把Gas Ballast阀旋转到原来关闭的 位置。对于ESI源，至少每星期做一次，对于 APCI源，每天做一次。4.4开高压之前一定要先开氮气，关氮气之前一定要先关高压。4.5 ESI离子化与溶剂密切相关，在使用某些溶剂和添加物需要注

24、意以下几个方面：三氟乙酸（TFA多用于蛋白质和多肽分析，但对 ESI离子化有抑制效应；三 乙胺（TEA在m/z 102处有较强的M+H+峰，有可能会抑制某些碱性化合物在正 离子ESI条件下的离子化，也有可能会增强某些碱性化合物在负离子ESI条件下的响应；4.6 要避免使用非挥发性的盐 （phosphate, borate, citrate, etc.）;表面活性剂、清洁剂和去污剂（会抑制离子化）；以及无机酸（sulphuric acid, phosphoric acid etc.） 等。4.7连接UPLC泵、色谱柱、注射泵以及 ESI探头时，要将仪器置于standby状液质联用仪操作规程第8页

25、共8页SOP I- Xevo-TQSFSIDC态。4.8.当改变分辨率的时候，仪器的质量数也会有轻微的偏移， 所以在不同分辨率的 条件下，应该做质量数校正。4.9样品贮存在塑料离心管中，其中的添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡 时间较长时，会产生干扰物信号。4.10工作站计算机不要安装与仪器操作无关的软件，要经常清理计算机磁盘碎片，定期查杀病毒，定期备份实验数据。4.11仪器应定期检查，并有专人管理，负责维护保养及清洁。4.12实验完毕要清洗进样针、进样阀等，用过含酸的流动相后，色谱柱、离子源 都要用甲醇/水冲洗，延长仪器寿命。4.13定期清洗样品锥孔：关闭隔断阀，取下样品锥孔，先用甲醇：水：甲酸（45: 45： 10）的溶液超声清洗10分钟，然后在分别用超纯水和甲醇各溶液超声清洗 10 分钟，待晾干后再安装到仪器上。当灵敏度下降时，需要清洗 Source、二级锥孔 和六级杆。4.14定期（每星期）检查机械泵的