植物的dna提取与鉴定

1、栢物的dna提取与鉴定.txt男人应该感谢20多岁陪在自己身边的女人。因为20岁是男人人 生的最低谷，没钱，没事业；而20岁，却是女人一生中最灿烂的季节。只要锄头舞得好，哪 有墙角挖不到？目的意义dna是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变杲、代谢调控等方而起着重耍作用，是 分了生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物dxa的结构和功能，还是开展外源dna 的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织小提取天然状态的高分子量的纯化dna。 因此，本实验的冃的是学习植物基因组dna提取方法、原理和dna的鉴定技术。i植物基因纽dna的提取（ctab法）一、原理栢物组织中绝大部分是核dna

2、,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或 染色体）的形式存在丁细胞核内。ctab （十六烷基三甲基決化hexadecyl trimethylammonium bromide,简称ctab）:是一种阳离了去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高 盐溶液（o. 7mol/l nacl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0. 3mol/l nacl）时从 溶液中沉淀，通过离心就可将ctab与核酸的复合物同蛋口、多糖类物质分开，然后将ctab 与核酸的复介物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，ctab能溶解于乙醇中。 在dna提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：

3、（1）dna的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰 胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（2）抑制内外源dnase的活力。dnase就象一把刀，它能把人分了的dna切成碎片，所以要 加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节ph,使偏碱（ph8.0）； c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂（edta）除去酶的铺助因子（mg2+）,使酶活性丧失。（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使dna降解，-般综合考虑，取 ph&o左右为宜。（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪

4、切等，dna分了特别人，其分了量可达1012 道尔顿，极易被机械张力拉断，其至在细管中稍急一些的流动也会使dna断裂，所以在抽提 过程中耍特別注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取冇十扰作川。 因此，一般尽町能选幼嫩的、代谢旺盛的新牛组织作为提取dna的材料，这是因幼嫩的新牛 组织次生代谢物较少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。分离提取植物dna的方法很多，木实验采用ctab法提取dna并通过紫外吸收法和电泳鉴定。二、操作方法（1）取200mg样品（在液氮屮研磨成粉末状）放入1.

5、 5ml离心管中，加入600 u l dna提取液, 颠倒混匀5-6次。65°c保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。（2）再加等体积的氯仿异戊醇（24： 1）溶液轻轻摇晃30秒,在4°c下loooorpm/分钟离心10 分钟后，取吸上清液（450 ul）（3）再加两倍体积的预冷界丙醇，混匀静止10分钟以上，在4°c下loooorpm/分钟离心10 分钟后，弃上清。（4）用600 n l70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。（5）沉淀用te溶液溶解dna,再加入rnase至终浓度50pg/ml,在37°c下保温半小时，将 dna样品放入冰箱保存。

6、ii植物dna纯度的鉴定紫外分光光度计法一、原理山于核酸中的碱基都貝有共轨双键，所以貝有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典 型的吸收曲线，其吸收高峰在260nni处，吸收低谷在230nni处。蛋白质在紫外区的吸收高峰 在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分 dna和rna,只能用來鉴定核酸的纯度和含量。纯度鉴定时,需测定在230、260和280nm处的消光值,经验数据表明,纯净的核酸溶液a260/a230的消光值比大于或等于2.0； a260/a280大于或等于1.80。 a260/a280值过小，说明蛋口未脱净；a260/a230过小，说明

7、有杂质(一般为多酚类或色索)。 含量测定时，对于纯净的dna来说，在实际应用屮可根据260nm处的消光值0. d260值换算成 含量,一般认为0. d260值为1时,相当于50ug/mlo在测定核酸粗制品时,样品中残留的 蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变 性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。二、实验材料、仪器及试剂1、材料植物dna2、器材：紫外分光光度计、移液竹、试管3、试剂：te溶液(ph8.0)(见前述)三、操作方法将纯化的dna溶液用te (ph& 0)稀释至每毫升含5-50 u g dna浓度范围，用te (

8、ph8. 0)作 空白对照,于紫外分光光度计上测定260nm. 280nm和230nm吸收值,计算a260/a230和 a260/a280的比值，并换算出核酸的含量。iii植物dna分子量的测定琼脂糖凝胶电泳法一、原理以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究屮，其操作简单、快速，是分离、鉴定、 纯化dna的标准方法。dna分子在高于其等电点的ph溶液带负电荷，在电场中向正极移动。 dna分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就 是说与分了大小构彖冇关。实验表明dna迁移率与其分了量的对数成反比。因此通过参比已 知标准分子量的dna迁移率，可测定样品dn

9、a的分子量。用低浓度的荧光物质，插入性染料 浪化乙锭(eb)使凝胶中dna区带染色，在紫外光下可总接显示dna在凝胶中的位置，灵敏 度很高，可检出10ng (10-9g)或更少的dna含量。二、实验材料、仪器及试剂1、材料：植物dna2、器材：水平板型电泳槽装直电泳仪254nm波长的紫外分析仪塑料手套移液管水浴锅3、试剂：(1) t ris-hac (tae)缓冲液a. 浓缩的贮备液(50 倍)每升含:242gtris 57. 1ml 冰醋酸,100ml 0. 5mol/l edta (ph8. 0)。b. 使用浓度：0. 04mol/l tris-hac/o. 04mol/l edta0(2

10、) 琼脂糖：电泳纯以上。(3) 漠酚蓝甘汕溶液(0.05%漠酚蓝-50%甘汕溶液)：先配制0.1%漠酚蓝水溶液，然示取1 份0. 1%漠酚蓝溶液与等体积的廿汕混合即成。(4) 已知分子量的标准 dna ( x dna-ecori/hind iii)。(5) lomg/ml 化乙锭水溶液(eb)或gv水溶液。三、操作方法1. 琼脂糖凝胶板的制备称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入loomltae缓冲液，在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解, 冷却至50°c,然后加入eb溶液使终浓度为0. 5 u g/mlo倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封 住有机物玻璃板的边缘）。使其成2nmi左右的凝胶板。在其未凝固前将样阳槽模板（梳了）插 入凝胶的一端，注意梳齿底与凝胶底z间应至少保持0. 5-1. 0mm的凝胶。待全部凝固后（室 温，约30-45分钟），取出梳子及除去胶带，将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入tae 缓冲液使刚好超过凝胶面约lmmo2. 加样：将样品与漠酚蓝按4： 1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔屮，点样量为 每孔 5 u gdnao3. 电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进 入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米5伏特左右的电压，dna在电泳中向正极移动。当澳酚蓝的