水曲柳中荷包花苷A的分离及测定

1、 科 研 训 练 报 告水曲柳中荷包花苷A的分离及检测学 生 姓 名专 业学 号指 导 教 师学 院 目的及要求：目的：通过科研训练，使学生能够在指导教师的指导下选定课题，完成实验，并写出具有一定质量的总结报告、学术论文或申请专利等；学生在毕业时将具有一定创新意识和创新能力、有一定参与实验和实践的能力以及分析问题和解决问题的能力，为今后独立开展科学研究工作奠定基础。要求：了解本专业的科研方法，受到较严格的科学思维训练。了解本学科某一方向发展的历史概况以及当代的某些新发展和应用前景。有较强的语言表达能力，掌握资料查询、文献检索以及运用现代信息技术获取相关信息的基本方法。能够对某一课题，进行文献检

2、索，收集资料，完成文献综述。了解科学论文、学士论文、硕士论文的国家标准定义，掌握学士论文的基本内容与要求。掌握科学论文的写作规范和写作的基本方法，具有一定的科学研究能力。主要内容：1、查阅文献，对水曲柳中的总苯乙醇苷类成分进行提取，可以采用有机溶剂提取法，摸索最佳的提取的溶剂种类、比例和提取时间；2、熟悉色谱分离方法的基本操作，熟悉旋转蒸发仪的使用，熟悉超声波在中药有效成分提取中的使用；根据已知化合物的物理化学性质，选择分离目标化合荷包花苷A的有效介质；3、设计对分离的荷包花苷A进行快速检测的方法，并对实验报告进行分析。成绩： 指导教师评语：水曲柳中荷包花苷A的分离及测定摘要:目的从水曲柳中分

3、离出较纯的荷包花苷A。方法采用大孔树脂吸附及硅胶柱层析提高对提取物的分离程度，采用薄层色谱法与标准样品比对进行检测。结果采用D101大孔树脂（Ø6cm，35cm高）吸附柱，使用乙醇为洗脱液，初步获得含有荷包花苷A的混合提取物，再通过硅胶柱（Ø4cm，24cm高）层析柱，使用乙酸乙酯、甲醇和甲酸为流动相，分离出较纯的荷包花苷A。结论大孔树脂吸附及硅胶柱层析提取条件工艺简单，成本低，节约能源，可增加水曲柳的利用率。关键词:水曲柳；大孔树脂；荷包花苷A；薄层色谱；硅胶柱层析第一章 引言水曲柳（Fraxinusm andschurica Rupr.）是一种落叶乔木，高度可达30m，

4、直径超过1 m，主要分布于我国大兴安岭东部和小兴安岭等地。水曲柳为优质木材，但水曲柳皮却没有被充分开发利用，只在民间作为抗风湿的偏方使用，其化学成分国外有见报道，国内很少有人研究，其药效价值还有待开发1。荷包花苷A（calceolarioside A）属于苯乙醇苷类化合物，已发现的苯乙醇苷类化合物在自然界的分布相当广泛，几乎分布在各个科属中，在较进化的双子叶植物纲合瓣花亚纲中，特别集中于玄参目和唇形目中，如：玄参科、木犀科、唇形科、马钱科等，而水曲柳正是木犀科植物。由于这类化合物分布广，药理作用强,目前对此类化合物的研究也逐渐成为学者们的研究重点2。采用大孔树脂进行天然化合物的分离纯化，常用于

5、分离纯化苷类化合物，同传统方法如溶剂萃取法相比，溶剂用量大为减少，在操作全过程中一般只使用水与乙醇作为溶剂，具有无残留，无污染等特点。D101大孔树脂树脂属于非极性，可用于吸附皂苷类及某些生物碱类化合物，本实验主要用于除去样品中的不需要的糖。硅胶层析的主要特点是能通过对混合物质中的不同成分吸附保留时间的差异，达到分离提纯的目的。其原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。可用于脱除芳烃物质或中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等3。1.1 水曲柳水曲柳属木犀科、梣属植物

6、，渐危种，是古老的残遗植物，分布区虽较广，但多为零星散生，是国家级重点保护野生植物。因砍伐过度，数量日趋减少，目前大树已不多见。实验材料为木樨科植物水曲柳的树皮，功效包括清热燥湿，清肝明目，活血调经。主要用于痢疾、牛皮癣、月经不调、白带等疾病。成分主要含有马粟树皮甙和微量的马粟树皮素；也含有虫白蜡，虫白蜡含酯类、游离酸、游离醇、烃类和树脂等。1.2 大孔树脂吸附法大孔树脂吸附分离技术是以采用特殊的吸附剂，从中药材提取液中有选择地吸附其中的有效成分，除去无效成分的一种提取精制的新工艺。此外，大孔吸附树脂还可应用于中药有效成分样品组成含量测定前的预分离。该方法具有设备简单、操作方便、节省能源、成本

7、低、产品纯度高、不吸潮等优点，因此大孔树脂吸附法在中药研究和生产中的应用日益广泛。将这种方法应用于中药有效成分的分离取得了相当显著的成果。近年来，大孔吸附树脂法已广泛地应用于中药有效成分的分离与精制。目前，该技术已在国内广泛用于纯化苷类、黄酮类、生物碱类成分。随着有关基础研究的进一步深入，以及相关标准、法规的进一步完善，大孔树脂精制纯化技术必将成为推动中药现代化的重要手段。1.3 硅胶柱层析硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。1.4 薄层色谱法薄层色谱

8、，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。待点样、展开后，根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。薄层色谱法同时也是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成

9、分的互相分离的目的。第二章 方法与结果2.1仪器与材料2. 1.1仪器GZX-9070 MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）,恒温水浴锅B-260，RE-5203旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。2. 1.2试剂水曲柳采自长白山；标准品；其它试剂为薄层层析硅胶HG/T2354-92 G&G254化学纯（青海洋化工有限公司）；D101大孔树脂；乙醇，乙酸乙酯，甲醇，磷钼酸分析纯（北京化工厂）；甲酸，CMC（羧甲基纤维素钠）（天津市光复科技发展有限公司）。2.2方法与结果2.2.1样品处理用95%乙醇浸泡水曲柳皮过夜，将浸泡后的上清液蒸发浓缩至膏状物质，然后通过水分散，再

10、依次经过乙酸乙酯和正丁醇萃取。取得正丁醇萃取的浸膏33.47g，加250mL水分散，制得待测样品液。2.2.2样品分离2. 2. 2.1大孔树脂分离先进行大孔树脂活化，用2倍体积95%乙醇浸泡大孔树脂24h。把95%乙醇浸泡过的大孔树脂用水分散加入Ø6cm的柱中，加35cm高，体积约为989cm3。用水和乙醇各2L依次冲洗，重复一次。上样前共加3L水冲洗大孔树脂，直至流出液中不含有乙醇（检测：加水不出现油状现象）。上样250mL后用2L水冲洗，直至流出液澄清（接近无色）。上样完成后，柱中样品占到柱高的25处；剩余的样品液中不溶于水的粘稠沉淀成分不明，收集待测。用30%乙醇约2.5L洗

11、脱样品，收集6瓶250mL流出液，编号，然后改用50%乙醇洗脱样品，收集8瓶250mL流出液，编号，最后用回收乙醇冲洗，收集全部流出液，直至流出液呈无色。将流出液、分别合并，蒸发浓缩为膏状物质，同时获得回收乙醇。2. 2. 2.2硅胶柱层析分离称取硅胶G 116.87g，加入溶剂（乙酸乙酯：甲醇：甲酸=36：4：1）后用玻璃棒充分搅拌，将搅拌均匀的匀浆缓慢倒入柱中，不断加入溶剂直至硅胶沉降完成，高度不再变化（硅胶柱Ø4cm，24cm高，体积约为301cm3）。硅胶柱上样量为3.5g（30%乙醇洗脱液浓缩至膏状，加硅胶G搅拌研磨至粉末），打开活塞后，样品液随溶剂流出（流速约1.25mL

12、/min）而在硅胶中向下扩展。在样品液（呈浅黄色）扩展到硅胶柱底部瓷板之前，将流出的溶剂再加入到硅胶柱中；当流出液呈浅黄色时，即开始收集，第一瓶流出液收集1h，约60mL；从第二瓶至第九瓶每隔40min收集一瓶流出液，流速约1mL/min，每瓶约40mL。2. 2.2. 3薄层色谱检测采用乙酸乙酯：甲醇：甲酸=18：2：1为扩展剂，首先对大孔树脂分离出的流出液进行检测，将、和标准品（A+B）（标准品A即荷包花苷A，B为香豆素类化合物）分别点样，扩展，然后先在紫外（254nm）下显色（黄），再用5%磷钼酸乙醇溶液显色（需加热）。经过检测后，观察到流出液含有A、B物质和另一物质（含量高），流出液含

13、有B物质（含量高）、A和另一物质，流出液仅含有B物质。因此，可直接将30%乙醇洗脱液浓缩制得的膏状物质进行硅胶柱层析，进一步分离纯化。通过对硅胶柱分离出的流出液进行检测，将第一至九瓶流出液和标准品（30%乙醇洗脱液）分别点样，扩展，然后用磷钼酸乙醇溶液显色。经过检测后，观察到流出液仅含有A物质，流出液含有A、B物质，流出液含有B物质（含量高）、A，、流出液含有另一物质。观察的结果（流出液）如图，因此，流出液中含有本实验所需要提取的荷包花苷A。第三章 讨论由于荷包花苷A的极性较大，故选择非极性的D101大孔树脂树脂来除去杂质，在洗脱时便使用极性大的乙醇洗脱；采用的大孔吸附树脂对苯乙醇苷的吸附量大

14、，解吸附完全，可有效去除糖类等水溶性杂质，操作简便，生产成本低，纯化后的提取物中该类成分的纯度大幅提高4，为进一步充分开发水曲柳的药用价值提供了研究基础。而由于极性较大的物质易被硅胶吸附，故在洗脱时使用极性中等的乙酸乙酯为主的溶剂洗脱，使荷包花苷A的分离纯化程度较高。在薄层色谱法检测时，由于前期出现了明显的拖尾，故向洗脱剂中加入了一定量甲酸来调整，使检测结果更确切。该提取工艺简单，成本低，节约能源，对研究水曲柳的提取分离具有一定的参考价值，适用于其他同类物质的提取分离。实验心得在整个实验过程中，各个组员相互协作，在老师的指导下认真完成实验。各位成员在实验过程中严格要求自己，规范操作，认真寻找实验失败原因，积极探讨，总结经验，从做实验过程中学会了很多。虽然，在实验过程中我们经常遇到阻碍和挫折,但是老师积极鼓励，认真教授，不辞辛劳地讲授，让我们明白了其中的道理。通过实验,我们掌握了基本的实验技巧，通过撰写论文，我们学会了查阅文献、参考资料等，掌控了一个实验的进度，懂得如何处理数据，分析结果，如何跟自己的组员更好的沟通，也学会了扎实动手，认真分析，仔细检验等好的实验习惯。参考文献1陈玉娟,张宏桂,孙严彤,王