N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法1

1、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法摘要：本发明提供了一种N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒的制备方法。目前，疫苗黏膜免疫递送系统的研究日益得到广泛关注，然而，疫苗具有在体内降解和消除快、生物利用度低，体内半衰期短、需要佐剂和反复注射接种，副作用大、程序繁琐等缺点。另外，目前，大部分动物病毒病（如鸡新城疫、禽流感等）的灭活疫苗虽然能诱导产生高水平的血清循环抗体IgG，但不能诱导黏膜免疫应答，也就不能阻止病毒的感染。利用可生物降解高分子材料纳米粒对疫苗进行包裹，不仅可以保护疫苗完成投递过程，避免体内酸碱环境

2、和酶类对抗原的破坏，而且能使抗原的释放方式、速度、部位等具有一定的选择性和可控性，利于实现疫苗的控制释放和靶向传输，为疫苗剂型和免疫途径的多样化提供了广阔的前景。同时，纳米粒还具有佐剂作用，能增强疫苗的抗原性，并优化免疫应答的类型，从而提高接种效率、增强免疫效果。但是，作为黏膜免疫的递送载体，需具备永久正电性和生理环境下的水溶性，因为这样可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。本发明以改性的壳聚糖N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride c

3、hitosan，N-2-HACC）、N,O-羧甲基壳聚糖（N,O-carboxymethyl chitosan，N,O-CMC）为原料，以新城疫病毒（NDV）为模型药物，采用聚电解质复合法制备载新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。本发明制备的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs具有良好的相容性和生物黏附性，克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低、易于规模化生产。权利要求书一种N-2-羟丙基三

4、甲基氯化铵壳聚糖和N,O-羧甲基壳聚糖的合成及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，其特征在于包括以下步骤：1、N-2-HACC合成采用ETA与壳聚糖的氨基开环反应合成N-2-HACC。 2、N,O-CMC合成采用氯乙酸法将壳聚糖碱化膨胀后与氯乙酸反应合成N,O-CMC。3、NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制备 采用聚电解质复合的方法制备N-2-HACC/N,O-CMC-NPs。4、根据权利要求1所述的N-2-HACC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（1）壳聚糖的脱乙酰化处理将脱乙酰度为85%壳聚糖分散在质量分数为30% NaO

5、H异丁醇溶液中，100条件下回流搅拌反应1h，倾去上清液，去离子水洗至中性；之后，再将壳聚糖分散在质量分数为30%NaOH异丙醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5h，倾去上清液，去离子水洗至中性。 （2）壳聚糖的浸泡处理将脱乙酰处理的壳聚糖溶于体积分数为1%乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物；之后，在500-1000r/min搅拌条件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH=9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分；最后，向滤饼中加入15mL异丙醇，搅拌30min、分散均匀，倒入三口烧瓶。（3）壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（ETA

6、）开环反应在N2保护条件下，将三口烧瓶升温至80，逐滴加入ETA的异丙醇溶液（9g/50mL），30min内滴完；反应12h后将三口烧瓶冷却至室温，加入150mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h，抽滤，冷冻干燥24h。（4）N-2-HACC精制将干燥后的N-2-HACC溶于去离子水中；之后，采用3G砂芯漏斗过滤，将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀；真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h；分装，充入N2密封室温保存。 5、根据权利要求2所述的N,O-CMC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（1） 溶胀 准确称取5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇，搅拌，浸泡2h。（

7、2） 碱化 向反应器中加入质量分数为30%NaOH溶液60mL，搅拌均匀后浸泡2h，得碱化壳聚糖。（3） 羧甲基化 准确称取20g氯乙酸，在搅拌状态下分数次加入到碱化壳聚糖中，60、反应8h，制得粗产品。（4） 精制 把粗产品用一定量的乙醇洗涤几次，除去醋酸钠、氯化钠等盐类，抽滤后于60下干燥24h，得精制品。6、根据制备权利要求3所述的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（1）取1mg/mL N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中缓慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量为108.5EID50），磁力搅拌3min混合均匀；（

8、2）在室温、无菌条件下，1200r/min磁力搅拌30min后，向其中匀速缓慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基壳聚糖溶液2mL；（3）将该溶液于4、12000r/min离心2min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。7、根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（1）所述的壳聚糖脱乙酰化处理的具体过程为：将脱乙酰度85%壳聚糖分散在质量分数为30% NaOH异丁醇溶液中，100条件下回流搅拌反应1h，倾去上清液，去离子水洗至中性；之后，

9、再将壳聚糖分散在质量分数为30% NaOH异丁醇溶液中，100条件下继续回流搅拌反应1.5h，倾去上清液，去离子水洗至中性。 壳聚糖脱乙酰采用间歇法或连续法，用NaOH异丁醇溶液处理。NaOH质量分数为15%-40%，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10-30mL，处理温度为90-120，处理时间为1.5-8h。8、根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（2）所述的乙酸溶液的体积分数为1%-3%，使用0.1mol/L-2.0mol/L NaOH溶液调节壳聚糖溶液pH使壳聚糖析出，析出后的壳聚糖经过浸泡处理，去离子水洗涤后加入了异丙醇分散均匀成浆状。9、根据权利要求1或4所述的方法，

10、其特征在于权利要求4的步骤（3）所述的ETA与壳聚糖的质量比为11-91。采用分批加料的方式逐滴加入ETA的异丙醇溶液，整个反应在N2保护条件下进行，反应结束后冷却至室温，加入冷藏处理的无水乙醇浸泡，抽滤后使用冷冻干燥。10、根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（3）所述的反应温度为75-85，反应时间为8-14h。11、根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（4）所述的N-2-HACC采用去离子水溶解，3G砂芯漏斗过滤，冷藏处理的丙酮沉淀的方法进行精制。12、根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于权利要求5的步骤（1）所述的浸泡时间为1-12h。13、

11、根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于权利要求5的步骤（2）所述的NaOH用量为10-40g，浸泡时间2-24h。14、根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于权利要求5的步骤（3）所述的氯乙酸/壳聚糖（v/w）分别为2.51到17.51，反应时间为2-10h，反应温度为40-80。15、根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于权利要求5的步骤（4）所述的滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，95%乙醇溶液洗涤，所得产品放入30-60真空干燥箱内干燥6-24h。16、根据权利要求3、6所述的方法，其特征在于所述的模型药物为20-300nm的L系新城疫病毒粒子。17、根据权利要求3或6所述

12、的方法，其特征在于权利要求6的步骤（1）所述的模型药物新城疫病毒液在制备纳米粒子前经过了去离子化处理。18、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于权利要求6的步骤（1）所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液浓度可为0.5-20mg/mL。19、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于权利要求6的步骤（1）所述的投药量可为1.25-7.5mL。20、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于权利要求6的步骤（2）所述的N,O-羧甲基壳聚糖溶液浓度可为0.5-3.0mg/mL。21、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于权利要求6的步骤（3）所述的搅拌速度可为900-1300r/min。22

13、、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于权利要求6的步骤（2）所述的搅拌时间可为10-40min。23、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制备完成后离心，用去离子水洗涤三次。24、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制备完成后冷冻干燥。25、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于制备的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs粒径为120-500nm。26、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于所述的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs表面电位为15-60mv。27

14、、根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于所述的纳米粒子的包封率在90%以上，载药量在45%以上。说明书技术领域本发明涉及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N,O-羧甲基壳聚糖的合成方法及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。背景技术新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种急性、高度接触性、致死性禽类传染病，该病在雏鸡、火鸡、鸽、鹤、鹌鹑和鹦鹉等其它鸟类中能引起100%发病和死亡。该病的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血，发病急、致死

15、率高，是危害养禽业的最严重传染病之一。目前，该病的预防和控制的最重要和最有效的手段是接种疫苗。但是，现有疫苗的普遍缺点是免疫原性较弱，需用较强的免疫佐剂或合适的黏膜免疫传递系统才能有效诱导免疫应答。纳米疫苗是一种运用可降解生物材料和纳米技术改进现有疫苗的剂型和投递方式，从而保护抗原、简化接种程序、提高免疫效果的新型缓释疫苗，而且也解决了传统给药方式所带来的给药不便和药物浓度不稳定的问题，降低了药物的毒性，提高了药物的疗效。壳聚糖作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性以及抗菌等特殊功能，然而，壳聚糖只能溶于酸性溶液的性能缺陷使其在这一领域的应用受到了极大限制

16、。因此，对壳聚糖进行化学改性，在壳聚糖分子上接入某些特殊基团改变其水溶性，可以极大扩展壳聚糖的应用范围。在更为理想的纳米载药粒子制备的设计中，寻求壳聚糖的水溶性途径已成为能否将其成功用作纳米载药粒子基质物质的关键。本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒具有独特的优势，不仅具有良好的生物相容性、稳定性强等优点，而且还由于N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N,O-羧甲基壳聚糖均具有很好的水溶性，带正电性等特点，使得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的应用范围得到了极大的扩展。 发明内容1、本发明的目的是提供一种利用两种电荷相反的壳聚糖衍生

17、物直接发生聚合来制备纳米粒的方法，并利用该纳米粒负载病毒的纳米疫苗制备方法。2、本发明的技术方案是把2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（ETA）连接到壳聚糖（CS）的氨基上，形成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan，N-2-HACC）；之后，再将N-2-HACC与N,O-羧甲基壳聚糖（N,O-carboxymethyl chitosan，N,O-CMC）聚合形成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒（N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。该发明采取新城疫病毒（L系）作为

18、模型药物。3、本发明包括以下步骤：（1）N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成1）壳聚糖的脱乙酰化处理将乙酰度85%的壳聚糖（11g）分散在质量分数为20%的（120ml 水30g NaOH）NaOH aq中，100下搅拌反应5h，静置，倾出上层清液，去离子水洗至中性（PH=7），抽滤，干燥。2）壳聚糖的浸泡处理将脱乙酰处理的6g壳聚糖溶于240ml 10%的乙酸 aq中，缓慢搅拌溶解数小时，逐渐滴入NaOH aq，调节壳聚糖溶液PH=9，有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，烘干。3）壳聚糖与环氧丙基二甲基二乙基氯化铵的开环反应将上述浸泡处理后的壳聚糖倒入三口烧瓶

19、中，加入60ml异丙醇，搅拌分散均匀后呈浆状。三口烧瓶升温至60，加入9g/50ml环氧丙基二甲基二乙基氯化铵异丙醇aq，30min内逐渐滴完，反应12h，反应结束后aq变澄清，烧杯底部有浅黄色粘稠物，冷却至室温。静置，分层，加入冷藏处理的无水乙醇300ml沉淀，粘稠物颜色变浅，浸泡0.5h，抽滤，65真空干燥。4）N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的精致将干燥后的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖溶于水，3G纱芯漏斗过滤，滤液在5倍体积丙酮中沉淀得到淡黄色沉淀物。在步骤（1）1）中，壳聚糖脱乙酰采用间歇法或连续法，用NaOH异丁醇溶液处理。NaOH质量分数为15%-40%，异丁醇的量为每

20、克壳聚糖加入10-30mL，处理温度为90-120，处理时间为1.5-8h。在步骤（1）2）中，乙酸溶液的体积分数为1%-3%，调节壳聚糖溶液pH的NaOH溶液浓度为0.1mol/L-2.0mol/L。在步骤（1）3）中，2,3-环氧丙基三甲基氯化铵ETA与壳聚糖的质量比为11-91，反应温度为75-85，反应时间为8-14h。本发明所使用的壳聚糖来源丰富，季铵化原料ETA已有工业化生产，生产成本低，适宜大规模生产。使用本方法合成的N-2-HACC取代度高，最高可达100%，水溶性良好。本发明所使用的壳聚糖来源丰富，季铵化原料2,3-环氧丙基三甲基氯化铵已有工业化生产，生产成本较低，适宜大规模

21、生产。使用本方法合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖取代度较高，最高可达100%，水溶性良好。本发明采用的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的取代度为50%-75%。（3）N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）的制备1）取1mg/mL N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中缓慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量为108.5EID50），磁力搅拌3min混合均匀；2）在室温、无菌条件下，1200r/min磁力搅拌30min后，向其中匀速缓慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基壳聚糖溶液2mL；

22、3）将该溶液于4、12000r/min离心2min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。在步骤（3）1）中，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液的浓度可为0.5-20mg/mL，步骤（3）2）中N,O-羧甲基壳聚糖的浓度为0.5-3.0mg/mL，投药量为1.25-7.5mL，搅拌速度为900-1300r/min，搅拌时间为10-40min。与壳聚糖纳米粒子相比，本发明制备的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs粒径容易控制，NDV-N-2-

23、HACC/N,O-CMC-NPs粒径为120-500nm之间，NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs Zeta电位在38mV左右，最大包封率可达98%。具体实施方式1、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成（1）壳聚糖的脱乙酰化处理将50g脱乙酰度为80%的壳聚糖分散在200mL质量分数为30%NaOH异丁醇溶液中，110回流搅拌反应1h，冷却，静置，倾去上清液，真空抽滤，去离子水洗至滤液呈中性；之后，再将上步处理的壳聚糖分散在200mL质量分数为30% NaOH异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5h，冷却，静置，倾去上清液，真空抽滤，去离子水洗至中性。 （2）壳聚糖的浸泡处理将3g

24、脱乙酰处理的壳聚糖溶于150mL体积分数为2%的乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物。500-1000r/min条件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH=9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分。滤饼中加入30mL异丙醇，搅拌30min分散均匀，倒入三口烧瓶。（3）壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应在N2保护条件下，将三口烧瓶升温至80，每隔2h逐滴加入定量的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，分三次加完，每次滴定时间控制在30min，反应12h后将三口烧瓶冷却至室温，加入300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h，

25、抽滤，冷冻干燥24h。（4）N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的精制将干燥后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，3G砂芯漏斗过滤，滤液在5倍体积的冷藏处理的丙酮中沉淀；真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h；分装，充入N2密封室温保存。图6为此条件下合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的取代度测定，取代度为34%。图7为此条件下合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系。2、N,O-羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：1）溶胀 准确称取5g干燥的壳聚糖粉末置于三口烧瓶中，加入40mL异丙醇，搅拌，使其常温溶胀2h。2）碱化 向反应器中加

26、入60mL10mol/L NaOH溶液，搅拌均匀后浸泡12h，得碱化壳聚糖，让壳聚糖在碱性条件下膨胀，形成碱化中心。3）羧甲基化 将20g氯乙酸水浴加热充分溶于10mL的异丙醇中，分五次加入溶液中，每次间隔10min，60、反应8h，得羧甲基壳聚糖混合物。4）精制 反应结束后，向溶液中加入20mL蒸馏水，1%盐酸调pH至7.0；布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，分别用95%乙醇、无水乙醇洗涤。所得产品放入真空干燥箱内干燥，即得白色粉状N,O-CMC。图11为此条件下合成的N,O-羧甲基壳聚糖的取代度测定，取代度为60%。图12为此条件下合成的N,O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系。（3）N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒子的制备：1）取1mg/mL N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中缓慢滴加入2mL新城疫L-系病毒液（病毒含量为108.5EID50），磁力搅拌3min混合均匀；2）在室温、无菌条件下，1200r/min磁力搅拌30min后，向其中匀速缓慢滴加入1mg/mLN,O-羧甲基壳聚糖溶液2mL；3）将该溶液于4、12000r/min离心2min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化