流式细胞术基本原理及应用PPT课件

1、流式细胞术流式细胞术=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, 简称简称FCM）是一种可以快速、准确、）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选以对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量第1页/共142页流式细胞仪系统流式细胞仪系统简介简介 通过

2、流式细胞仪我们可以得到以下信息通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 -相对细胞大小相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度染色过细胞的相对荧光强度第2页/共142页Injector TipSheath fluid第3页/共142页流式细胞仪的光信号流式细胞仪的光信号 散射光信号 荧光信号第4页/共142页1. 散射光信号散射光信号前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号入射激光的同向散射光信号 细胞相细胞相 对大小及其表面积。对大小及其表面积

3、。 侧向角散射（侧向角散射（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter） 入射激光入射激光9090 角的角的散射光信号散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。细胞粒度及细胞内相对复杂性。第5页/共142页前向角散射光前向角散射光 FSCFALS SensorLaser第6页/共142页侧向角散射光侧向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser第7页/共142页散射光散射光 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 -通常使用通常使用“散点图散点图”来看散射光信号来看散射光信号 -散点图上

4、的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据第8页/共142页散点图散点图Dot Plotlysed whole blood第9页/共142页Review QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?第10页/共142页2. 荧光信号荧光信号=荧光素吸收激光能量荧光素吸收激光能量=荧

5、光素将吸收能量释放，转换为荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子释放较入射光波长更长的光量子=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强第11页/共142页荧光检测器荧光检测器FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)第12页/共142页Two-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most A

6、b A binding sites?Ab AAb B第13页/共142页双色荧光散点图双色荧光散点图第14页/共142页现代流式细胞仪包括现代流式细胞仪包括 液流系统液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统光学系统 激发和收集光信号 电子系统电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析 第15页/共142页液流系统液流系统 液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处第16页/共142页Sample Flow in Optical CuvetteSampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlo

7、wSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min第17页/共142页Review QuestionWhich of the following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cuvette? A. bubblesB. cellular concentrationC. sample flow rate 第18页/共142页Optics Excitation optics consist of:- Lasers- Lenses and mirr

8、ors that route the laser light to the fluidic stream Collection optics consist of:Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors第19页/共142页Optical Filters460 500 540460 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass第20页/共142页FACSCalibur光路图光路图第21页/共142页OpticsLaserLaserFluorochromesF

9、luorochromesDetector Detector ParameterParameterFilterFilter第22页/共142页Electronics Converts analog signals to proportional digital signals Computes Height for each pulse Calculates width and area Interfaces with the computer for data transfer 第23页/共142页Creation of a Voltage Pulse - Analog SignalTimeV

10、oltageTimeVoltageTimeVoltage第24页/共142页Quantification of a Voltage PulseTimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0 Height is a measurement for all parameters. Width = Area/Height第25页/共142页Effect of the Instrument Controls on the Data第26页/共142页Review FL2FL1SSCFSCFL4FL3第27页/共142页Review Questions1. Whi

11、ch of the following fluorochromes cannot be used with the FACSCalibur?a. DAPI (ex. 345 nm, emits 455 nm)b. Propidium Iodide (ex. 536 nm, emits 617 nm)c. Alexa Fluor 647 (ex. 650 nm, emits 668 nm)2. What are the three measurements of a particle that can be determined by FACSCalibur?3. Briefly describ

12、e the functions of the fluidics, optics, and electronics systems.第28页/共142页Review Questions4.What would happen to the population below if you increased the Red parameter value in the Instrument controls?第29页/共142页Review Questions5.Which instrument components ensure that the fluorescence signal of a

13、specific fluorochrome is only measured by a designated detector? For example, APC is only measured by the FL4 detector. 第30页/共142页样本处理样本处理第31页/共142页细胞悬液的制备细胞悬液的制备 细胞悬液：细胞悬液： 分离分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操

14、作简便，样本用血量小本用血量小 灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系 实体组织：实体组织： 病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质第32页/共142页步骤一：步骤一： 选择合适的荧光染料选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少第33页/共142页荧光产生过程荧光产生过程第34页/共142页Propidium Iodide400 nm500 nm6

15、00 nm700 nmR el at i ve I nt ensi t yPIExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第35页/共142页Fluorescein (FITC)400 nm500 nm600 nm700 nmR el at i ve I nt ensi t yWavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第36页/共142页300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmPhycoerytherin (PE)Protein第37页/共142页Allophyc

16、ocyanin (APC)300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm第38页/共142页FITC和和PE荧光光谱荧光光谱第39页/共142页补偿模型图补偿模型图第40页/共142页补偿调节前后对比补偿调节前后对比FL1FL2第41页/共142页步骤二：步骤二： 染色染色体积温度孵育时间对照第42页/共142页直接染色直接染色 Fluorescent probe attached to antibody Specific signal: weak Nonspecific binding: low第43页/共142页间接染色间接染色 Fluorescent probe a

17、ttached to a 2nd antibody Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: high第44页/共142页Avidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dye第45页/共142页示意图示意图第46页/共142页步骤三：步骤三： 数据收集和分析数据收集和分析 画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？第47页/共142页仪器设置调节仪器设置调节1.

18、 用未染色细胞调整仪器用未染色细胞调整仪器PMT电压电压2. 用单染色的细胞调节仪器补偿用单染色的细胞调节仪器补偿第48页/共142页关于同型对照关于同型对照 例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, IgG1 FITC第49页/共142页数据分析数据分析 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对

19、数或抗体结合数第50页/共142页如何设定阴性与阳性的界限如何设定阴性与阳性的界限第51页/共142页第52页/共142页第53页/共142页直方图直方图第54页/共142页散点图散点图第55页/共142页细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特核的特异性抗原异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在

20、上述信号基础上的细胞分选在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用第56页/共142页流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用=HIV免疫分型，免疫分型，CD4绝对计数绝对计数=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=残量白血病细胞检查残量白血病细胞检查=HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病第57页/共142页流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=免疫功能研究免疫功能研究=癌症病人

21、的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=动物性别筛选动物性别筛选=海洋与环境微生物分析海洋与环境微生物分析=染色体分选染色体分选第58页/共142页流式细胞仪的遗传学应用细胞细胞DNA, RNA 含量的测定含量的测定染色体倍体分析染色体倍体分析染色体分离染色体分离基因表达产物的生物活性研究基因表达产物的生物活性研究基因转染表达的生物效应基因转染表达的生物效应基因表达调控研究基因表达调控研究细胞内基因定位细胞内基因定位酵母转基因株的筛选酵母转基因株的筛选报告基因的定性定量检测报告基因的定性定量检测植物遗传学研究植物遗传学研究 第59页/共142页 Flow Cyt

22、ometry in clinics and research第60页/共142页What can Flow Cytometer tell us about a cell?Cell Lineage/Subset PhenotypeCytokine/ChemokineProduction RepertoireCytokine/ChemokineReceptor RepertoireMigration/Homing PhenotypreCell cycle status第61页/共142页细胞增殖（细胞周期）细胞增殖（细胞周期） 细胞内DNA含量 增殖相关基因的表达 BrdU的结合 示踪染料第62页

23、/共142页DNA 探针探针DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学正比化学正比关系的这样，带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当，从而检测DNA含量第63页/共142页 Nucleic acid Probes菲啶基Propidium IodideEthidium Bromide苯甲亚胺Hoechst 33342抗生素Mithramycin, Chromamycin A3Acridine Orange - AOPyronyn Y第64页/共142页0 200 400 600 8001000DNA contentCountNormal Cell Cycle 第65页/共142

24、页A typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of Events第66页/共142页红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞细胞第67页/共142页第68页/共142页 增殖相关基因增殖相关基因PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 一种蛋白质，在DNA复制和核苷酸的切除修复中起到作用Ki-67 - proliferation related antigenKi-S1 - proliferation related antigenPhospho-his

25、toneCyclin D1, E, A, B1 第69页/共142页 BrdUrd IncorporationBromodeoxyuridine (BrdU) 是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合使用BrdU抗体能够检测到BrdU第70页/共142页 BrdUrd Incorporation第71页/共142页 细胞分裂的分析细胞分裂的分析 哺乳动物的免疫系统需要有大量的增殖，能够确保抗原特异性的T细胞和B细胞具有足够的增殖速度，能够对付治病生物造成的感染 CFSE是一种示踪染料，能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出

26、8-10代的子细胞。 第72页/共142页Tracing Dye(CFSE)第73页/共142页 Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis第74页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death 细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化第75页/共142页第76页/共142页

27、Flow cytometry of apoptotic cell death 荧光吸收 细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞第77页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death FCM of Caspases 通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物 新的抗原决定基CK18第78页/共142页第79页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death TMP会

28、在调亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探针。 当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白7A6抗原会出现 Bcl-2/bax family of proteins. 第80页/共142页第81页/共142页第82页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death 胞浆内Ca2+ 水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。 使用Ca2+ 选择性荧光探针，如 Quin-2, Fluo-3, In

29、do-1 通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案 酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测 第83页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death第84页/共142页第85页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death DNA 链的断裂链的断裂 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。 断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(T

30、dT)连接上dUTP。第86页/共142页第87页/共142页第88页/共142页第89页/共142页Flow cytometry of apoptotic cell death 细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。第90页/共142页Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI - Fluorescence# EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells第91页/

31、共142页 An Integrated Approach to Cell Immunology第92页/共142页Immune Function assay 免疫细胞亚群检测免疫细胞亚群检测 Antigen-peptide specific T cells 检测检测 T-cells 活化活化 Treg Cells 细胞内细胞因子细胞内细胞因子/趋化因子检测趋化因子检测 磷酸化磷酸化第93页/共142页淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病

32、NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。第94页/共142页淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血第95页/共142页第96页/共142页Traditi

33、onal Analysis - Percent positivePositive cellNegative Cell CD4 PECD4 PE第97页/共142页Absolute Counts - Cells per m mLPositive CellAbsolute Count BeadsNegative CellCD4 PECD4 PE第98页/共142页抗原特异性抗原特异性T细胞细胞 提供检测者一个强有力的工具用于研究对病毒抗原的免疫应答和疫苗的开发第99页/共142页MHC: Class I and Class II Gene Products T cell受体不直接和可溶性抗原相连受

34、体不直接和可溶性抗原相连 抗原必须通过MHC由抗原呈递细胞传递给T细胞 (Macrophages, Dendritic cells, B cells) MHC Class I Gene Products 呈递抗原给 CD8+ T cells 诱导细胞毒应答 MHC Class II Gene Products 呈递抗原给 CD4+ T cells 诱导细胞因子产生，免疫球蛋白的分泌第100页/共142页MHC/TCR Signaling第101页/共142页二聚体可溶性二聚体可溶性MHC类似物与四聚体的比类似物与四聚体的比较较第102页/共142页Quantitation of antigen

35、-specific T lymphocytes in peripheral blood HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/Ig第103页/共142页Treg细胞的检测细胞的检测 Treg细胞与自身免疫耐受相关，通常的检测方法用CD4阳性细胞中CD25高表达，同时结合胞内FoxP3含量来判断 最新发现人的Treg细胞低表达CD127。CD127的表达模式与Foxp3很接近，说明低表达CD127，高/中表达CD25的CD4阳性的T淋巴细胞就是Treg细胞（调节性T细胞）。该方法比胞内检测Foxp3的优点在于，检测后的细胞可用于后续的培养及其他的体外试验。另外的优点是用

36、这种检测方案分选的Treg细胞得率更高。 第104页/共142页第105页/共142页Immune Function Assays - A Powerful Research Tool for Answering Basic Biological Questions in. AIDS或癌症机理的研究或癌症机理的研究 T cell亚群对于病毒和细菌抗原的反应亚群对于病毒和细菌抗原的反应 细胞介导的对机会感染的免疫反应细胞介导的对机会感染的免疫反应 药物药物/疫苗的效果评价疫苗的效果评价 免疫调节免疫调节 移植监控移植监控 毒理研究毒理研究第106页/共142页第107页/共142页第108页/共

37、142页第109页/共142页Traditional Cytokine Flow CytometryIL-2 PhycoerythrinCD4 FITC第110页/共142页细胞因子检测细胞因子检测 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。第111页/共142页T细胞的细胞因子分型细胞的细胞因子分型=型细胞介导免疫反应=引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调=刺激来源：病毒、某些细菌=型体液介导免疫反应

38、=引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调=刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源第112页/共142页细胞因子细胞因子第113页/共142页Biological Variation Among CMV-seropositive Donors in Response to CMV第114页/共142页CFC & Proliferation使用温和的方法进行细胞破膜和固定，在中性pH值条件下，使细胞和BrdU结合，可以同时检测到： S期 细胞周期 表型 活化状态 核型决定基 胞浆内决定基 细胞因子/趋化因子 其他. 第115页/共142页CFC & ProliferationA

39、llows the correlation of: Phenotype Cytokine expressionCell CycleProliferation第116页/共142页BD Phosflow磷酸化检测系统磷酸化检测系统 更好的特异性的抗体 建立在单个细胞基础上的检测 可以同时检测多个参数 快速、灵敏、样本量更少第117页/共142页PPYYYY非磷酸化特异性抗体检测全部的相关蛋白 unphosphorylated + phosphorylated亚型 抗原：重组的蛋白质片断磷酸化特异性抗体 仅仅检测磷酸化亚型 抗原：合成的 4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特异性和非磷酸化特异性抗体的

40、差异第118页/共142页BD PhosFLOW和和Western blot 的比较的比较A theoretical experiment comparing Western blot and flow cytometry with three samples and a protein of interest at 1, 10, or 50 copies per cell. Sample 2 and 3 look the same via Western blot, but when stained with fluorescently labeled antibodies, the dif

41、ferences between the samples become more relevant. (Source: P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206221)第119页/共142页BD PhosFlowGenomics & Proteomics - Single Cells Have Big Proteomics Story to Tell. BD PhosFlow not only tells you activation of a single cell for one particular phos

42、pho protein and pathway, but allows you to study multiple phosphorylation events and pathways simultaniously.第120页/共142页100101102103104100101102103104PBMC050100150200250FSC-H050100150200250SSC-HCD20 PerCP-Cy5.5CD3 PE Zap70 (Y319)/Syk (Y352) Alexa 647 1001011021031040204060801001001011021031040204060

43、80100100101102103104020406080100100101102103104100101102103104CD3 PE 100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100CD3-/CD20+ CD3+/CD20- CD3-/CD20-CD20 PerCP-Cy5.5Whole Blood CD3 CrossLink 050100150200250FSC-H050100150200250SSC-H21.8Multi-Color PhosFlow in CD3/CD28

44、 or CD3 crosslinked human PBMCs or Whole BloodCD3/CD28 CrosslinkUntreated cells (unshaded) vs treated cells (shaded)第121页/共142页BD CBA 一种一种“三明治三明治”免疫测定法免疫测定法 使用结合有高亲和性抗体的小球，用来特异性地捕获可溶性的抗原. 用荧光检测抗体来检测被捕获的抗原 使用流式细胞仪进行检测分析第122页/共142页第123页/共142页Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, em

45、itting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.第124页/共142页Multiplexed Beads0 pg/mL80 pg/mL1250 pg/mL5000 pg/mLFL3 Beads FL2 (PE)第125页/共142页使用使用 BD Cytometric Bead Array(CBA) 系统你可以系统你可以: 从单一小体积样本中得到多项检测结果 对所有的检测项目，只需

46、要制备一个标准混合物来绘制标准曲线 避免人为造成的酶联放大的假阳性信号产生 用更少的时间和精力，却得到大量的结果 如果是用488nm和635nm两根激光器来实验，实验条件更容易建立 使用配有HTS选件的BD流式细胞仪可以做到自动平板上样和高通量检测第126页/共142页目前目前CBA主要提供的检测内容主要提供的检测内容 可溶性细胞因子 细胞凋亡相关蛋白 磷酸化蛋白第127页/共142页BD CBA Flex SetABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-AOld Format BD CBA BeadsBD CBA Flex Se

47、t Beads第128页/共142页更为灵活强大的更为灵活强大的CBA Flex Set 最多可同时检测72个项目 可自由选择搭配检测项目 检测项目范围更广泛 需要488nm和635nm两种波长的激光器ABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-A第129页/共142页9 9个指标同时检测活化个指标同时检测活化T T细胞细胞1234567891. Itk (Y511)2. ERK (T202/Y204)3. JNK (T183/Y185)4. P38 (T180/Y182)5. PLCg g (Y783)6. ZAP70 (Y319

48、)7. LAT (Y171)8. c-Jun (S63)9. RSK (S380)第130页/共142页Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-Kinetics of Jurkat Cell Activation With Anti-CD3/CD28CD3/CD28110100FOLD INCREASE IN UNITS/ML05101520TIME (MINUTES)RSK (S380)Jun (S63)LAT (Y171)Itk (Y511)ZAP-70 (Y319)PLCg g (Y783)P38 (T180/Y182)JNK (T183

49、/Y185)ERK (T202/Y204)P-Specific Antibodies第131页/共142页Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (Control)(Control)LckZAP-70PItkPPMAPKKKPIKKPNF-kBRasGrb2SOSRacPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPPPP PPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4

50、LATPPRSKSpecificitySpecificity UnstimulatedUnstimulatedAnti-CD3Anti-CD3Change Change % of Control% of ControlZAP-70108763655100Itk3711477100LAT42212170100PLCg609881272100ERK10430502946100JNK131272141100p3852729252398100c-Jun209351142100RSK55440385100Cells were activated with anti-CD3/CD28 for 2 minu

51、tes. SDS was added to a final concentration of 1% and the material was placed in a boiling water bath for 5 minutes.第132页/共142页Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA Monitoring the T Cell Activation Pathway by CBA (PD-98059)(PD-98059)LckZAP-70PItkPPMAPKKKPIKKPNF-kBRasGrb2SOSRacPPPLCPPDAGPKCPVAVSLP-76PLATPPPP PPPPPPRasMEKERKJNKp38MKK4,7MKK3,6MEKK1-4ElkJunATF2MEKK4LATPR