蛋白质工程2016

1、2021-11-161一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述2021-11-163全球生物制药的市场快速增长，目全球生物制药的市场快速增长，目前已达前已达1970亿美元，其中亿美元，其中重组蛋白重组蛋白和抗体类药物和抗体类药物占绝大部分。占绝大部分。截止到截止到2012年，在欧洲或美国获准年，在欧洲或美国获准上市的上市的430多种生物药品中，多种生物药品中，超过超过300 种是重组蛋白和抗体药物。种是重组蛋白和抗体药物。据统计，截止据统计，截止 2013年，年，超过超过900种种基于蛋白和多肽类的药物基于蛋白和多肽类的药物正处于研正处于研究和开发阶段，用于治疗超过究和开发阶段，用于治疗超过100

2、种疾病。种疾病。一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述胰岛素是糖尿病治疗的最有效药物胰岛素是糖尿病治疗的最有效药物猪猪人人 全球已诊断的型糖尿病患者达1.3亿人，我国已超过4000万人.中国城市人口治疗糖尿病每年直接人均医疗花费为451美元，治疗患有糖尿病并发症的患者花费则高达1694美元。在糖尿病用药中，胰岛素是最有效的糖尿病治疗药物之一，也是1型糖尿病人惟一的治疗药物。此外，还有30%40%的2型糖尿病患者最终需要使用胰岛素。 4一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述速效胰岛素速效胰岛素-人胰岛素的类似物人胰岛素的类似物天然胰岛素的缺点天然胰岛素的缺点:皮下组织内容易自身聚合因为皮下注射的药用

3、浓度远高于生理浓度，导致吸收起效变慢，患者必须餐前提前30min注射。解决思路：解决思路：鉴于胰岛素样生长因子IGF-1在组织液中是以单体形式存在,将胰岛素B链的B28-B29的残基序列颠倒成IGF-1 相应序列或向胰岛素引入带电荷或具有大的侧链的残基,以阻碍二聚体的形成。5一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述ProThrGlyTyrPhePhe GlyArgGluGlyValLeuTyrLeuAlaGluValLeuHisSerGlyCysLeuHisGlnAsnValPheB1A21B28B30A1AsnTyrAsnGluLeuGlnTyrLeuSerLieSerThrCysGlnGluV

4、alLieCysCysCysCysThrLysProAsp 将人胰岛素将人胰岛素B28氨基酸变成为门冬氨基酸（氨基酸变成为门冬氨基酸（Asp）后形成人胰）后形成人胰岛素类似物，取名为门冬胰岛素。门冬胰岛素是速效胰岛素。岛素类似物，取名为门冬胰岛素。门冬胰岛素是速效胰岛素。课堂互动：不同蛋白质的课堂互动：不同蛋白质的PIPI不同，含碱性氨基酸多的蛋白质不同，含碱性氨基酸多的蛋白质PIPI较高，含酸性氨较高，含酸性氨基酸多的蛋白质基酸多的蛋白质PIPI较低。门冬胰岛素比人胰岛素多了一个天冬氨酸，其较低。门冬胰岛素比人胰岛素多了一个天冬氨酸，其PIPI会偏会偏高还是低？这有怎样的药理学意义？高还是低

5、？这有怎样的药理学意义？一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述门冬胰岛素不需要糖尿病患者饭前门冬胰岛素不需要糖尿病患者饭前30min打针！打针！一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述8胰岛素的缓释改造胰岛素的缓释改造-超长效胰岛素超长效胰岛素改造的意义：胰岛素属小分子蛋白,皮下注射进入血液后被快速代谢, 给药频繁。维持血药浓度,防止胰岛素浓度过高造成低血糖。对于胰岛素基础分泌缺损的患者最有意义。一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述9 地特胰岛素是长效胰岛素20132013年销售额年销售额1818亿美元亿美元一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述 甘精胰岛素，甘精胰岛素，也是长效胰岛素，每天一针可以满

6、足也是长效胰岛素，每天一针可以满足患者一天的基础胰岛素需要患者一天的基础胰岛素需要不同项不同项甘精胰岛素甘精胰岛素人胰岛素人胰岛素A21GlyL-AsnB30两个两个L-ArgL-Thr结构特点：结构特点：分析：分析： 天冬酰胺是天冬酰胺是中性中性大侧链大侧链氨基酸而氨基酸而甘氨酸（甘氨酸（GlyGly）是中性）是中性小侧链小侧链氨基酸氨基酸l 这一变化使得分子间聚合的空间位阻减小，这一变化使得分子间聚合的空间位阻减小，容易聚合。容易聚合。 苏氨酸（苏氨酸（ThrThr）是中性氨基酸而精氨酸是碱性氨基酸）是中性氨基酸而精氨酸是碱性氨基酸l 这一变化这一变化使得分子的使得分子的PIPI提高，接近

7、于体液的中性环境，使得该分提高，接近于体液的中性环境，使得该分子在体液环境下子在体液环境下带电减少，容易聚合。带电减少，容易聚合。一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念简言之就是按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质简言之就是按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。的过程。基于对蛋白质结构、理化特性、生物学功能及生物合成等研究，通过生物技术手段有目的地改造蛋白质或制造一种全新的蛋白质的过程。因为需要利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造，被称为“第二代基因工程第二代基因工程”。一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述基因工程

8、基因工程蛋白质工程蛋白质工程相同点相同点都要改造基因，都属于分子水平都要改造基因，都属于分子水平产生的基因产生的基因无新基因无新基因有新基因有新基因产生的蛋白质产生的蛋白质原有的原有的新的新的联系联系蛋白质工程是基因工程的应用和延伸蛋白质工程是基因工程的应用和延伸蛋白质工程与蛋白质工程与基因工程基因工程12一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述13一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述新蛋白产生途径新蛋白产生途径自然突变：基因的自然突变率极低，会产生新的蛋白质（自然进化）。自然突变：基因的自然突变率极低，会产生新的蛋白质（自然进化）。蛋白质工程：通过基因的突变技术有目的性的改造蛋白质，速度远比自蛋

9、白质工程：通过基因的突变技术有目的性的改造蛋白质，速度远比自然进化快。然进化快。酶工程与蛋白质工程的比较酶工程与蛋白质工程的比较酶工程：酶工程：重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。蛋白质工程：蛋白质工程：重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。随着蛋白质工重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。部分。14一、蛋白质工程概述一、蛋白质工程概述 需要是创新的第一动力，需要是创新的第一动力， 需求是发明创造的源泉和方

10、向，需求是发明创造的源泉和方向， 而科学的知识是发明创造的工具。而科学的知识是发明创造的工具。15二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展课堂讨论：对此你有深切的感受吗课堂讨论：对此你有深切的感受吗? ?让让你思想的你思想的“火化火化”照亮我们混沌的照亮我们混沌的心路。心路。medicationDEMANDSl蛋白质药物的稳定性l半衰期l不良反应l免疫原性16二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展Catalyst for industriesDEMANDSl热稳定性l化学稳定性l压力稳定性l催化效率17二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展Agricul

11、ture DEMANDSl生物学活性l稳定性Cow-Henry from Roslin InstituteMilk with high concentration of a1-antitrypsin18二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展 Francis Crick, James Watson, 19621968 Robert Holley, Gobind Khorana, Marshall Nirenberg1933 Thomas Hunt Hunt Morgan 19生物技术的发展是蛋白质工程产生的基础生物技术的发展是蛋白质工程产生的基础二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质

12、工程的产生与发展Werner Arber ,1978, restriction enzymesMichael Smith,1993, Point mutationFrederick Sanger ,1980, DNA SequencingSevero Ochoa, 1959, Synthesis of RNAKary B. Mullis, 1993, PCR20二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展Gerald M. Edelman,1972, Antibody structure Frederick Sanger, 1958, Structure of insulin Bruc

13、e Merrifield, 1984, Peptide Synthesis21二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展John B. Fenn, Koichi Tanaka, Kurt Wthrich, 2002, Mass and NMR Herbert A. Hauptman, Jerome Karle, 1985, X-Ray Crystal22二、蛋白质工程的产生与发展二、蛋白质工程的产生与发展蛋白质结构与功能分析蛋白质结构与功能分析 蛋白质蛋白质结构与功能的设计与预测结构与功能的设计与预测 改造或创造新蛋白质改造或创造新蛋白质三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内

14、容231 1、蛋白质结构与功能分析蛋白质结构与功能分析（研究核心）研究核心）获取大量的蛋白质分子结构的信息获取大量的蛋白质分子结构的信息形成蛋白质结构与功能之间关系的数据形成蛋白质结构与功能之间关系的数据形成蛋白质结构与功能之间关系的理论形成蛋白质结构与功能之间关系的理论三维空间结构的测定：证明新结构改变了原有生物功能的必需三维空间结构的测定：证明新结构改变了原有生物功能的必需手段手段 24三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容晶体学分析技术（晶体学分析技术（x x射线晶体结构分析）射线晶体结构分析）对分析样品的要求：对分析样品的要求：l高度的均一性。影响样品高度的均一性。影响样品均

15、一性均一性因素：因素：金属离子、辅酶或一些成键的辅助基团的变化或缺失；金属离子、辅酶或一些成键的辅助基团的变化或缺失；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的聚合效应等。蛋白质的聚合效应等。l晶体生长的生化条件：晶体生长的生化条件：pHpH值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓度等因素度等因素缺陷：需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克缺陷：需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克- -几十毫克），制备几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析蛋白质结构分析主要技术蛋白质结构分析主要技术25三

16、、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容多维核磁共振波谱技术多维核磁共振波谱技术 二维同核核磁共振方法：对氢原子核的二维核磁共振信号进行分析，主要用于类蛋白质。 多维异核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白质和螺旋的多肽 进行分析。冷冻电镜冷冻电镜技术技术 避免了普通电镜制样的脱水过程，不破坏蛋白正常结构并且分辨率更高，尤其适用于大分子蛋白复合体的结构解析。26蛋白质结构分析主要技术蛋白质结构分析主要技术三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容27施一公施一公 1.Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 A

17、ngstrom Resolution, 10.1126/science.aac7629 2. Structural basis of pre-mRNA splicing. 10.1126/science.aac8159三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容蛋白质空间结构的测定已经成为生命科学的“瓶颈”美国NIH投资1.25亿美元，计划测定1万个蛋白质晶体结构；日本RIKEN将建16台高分辨率核磁共振仪，用来测定小分子蛋白质结构技术上的障碍：在克隆、表达、纯化和结晶过程中，大约20个蛋白质中能得到1个可供结构测定的晶体，并且一些蛋白质（膜蛋白）根本不可能被结晶现阶段主要研究手段：根据氨

18、基酸序列从理论上计算其相应空间结构成为蛋白质领域内科学家们的奋斗目标研究现状28三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容2 2、结构与功能的设计与预测、结构与功能的设计与预测 通过对天然蛋白质结构与功能分析，建立起蛋白质结构与功能数据库。利用此数据库，通过比对检索，可以预测某一氨基酸序列的肽链可能形成的空间结构和具备的生物学功能。同理，根据特定的生物功能，可以设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构 。29三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容生物信息学分析技术生物信息学分析技术蛋白质结构的预测和设计：蛋白质结构的预测和设计：30三、蛋白质工程的研究内容三、蛋白质工程的研究内容物理、

19、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等 基因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质 313 3、改造或创造新蛋白质、改造或创造新蛋白质 蛋白质改造的基本路径蛋白质改造的基本路径 分离纯化分离纯化目标蛋白质目标蛋白质 分析分析 蛋白质的蛋白质的一级结构一级结构 分析分析蛋白质的三维结构及蛋白质的三维结构及结构与功能的关系结构与功能的关系根据蛋一级结构设计根据蛋一级

20、结构设计引物、克隆目的基因引物、克隆目的基因根据三维结构和结构与根据三维结构和结构与功能的关系及蛋白质改功能的关系及蛋白质改造的目的设计改造方案造的目的设计改造方案对目的基因对目的基因定点突变定点突变改造后的基改造后的基因在宿主细因在宿主细胞中表达胞中表达分离纯化表分离纯化表达的蛋白质达的蛋白质分析功能和评价分析功能和评价是否达到设计目的是否达到设计目的32 蛋白质组学、生物信息学等学科的发展为蛋白质工程提供了必要的基础：蛋白质组学：蛋白质组学：蛋白质组学是阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科;包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作

21、用等。生物信息学：生物信息学：是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。l水蛭素改造水蛭素在临床上可作为水蛭素在临床上可作为抗栓药物抗栓药物用于治疗血栓疾病。用于治疗血栓疾病。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，它有多种变异体，由由6565或或6666个氨基酸残基组成。个氨基酸残基组成。在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2HV2的设计方案：的设计方案：将将4747位的位的AsnAsn（天冬酰胺）变成（天冬酰胺）变成LysLys（赖氨酸），使其与

22、分子内第（赖氨酸），使其与分子内第4 4或第或第5 5位位ThrThr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N N端肽链的正确取向，从而提端肽链的正确取向，从而提高抗凝血效率高抗凝血效率试管试验活性提高试管试验活性提高4 4倍倍在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高2020倍。倍。三、蛋白质工程的应用实例分析三、蛋白质工程的应用实例分析l生长激素的改造生长激素的改造生长激素的功能特点：结合生长激素的功能特点：结合生长激素受体，生长激素受体，促进细胞和机体的生促进细胞和机体的生长发育；结合许多种不同类型细胞的长发育；结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体催乳激素受体，引发其他生，引发其他生理过程。理过程。改造目标及方法：只与生长激