PCR技术原理与操作

1、PCR技术原理与操作技术原理与操作主要内容主要内容一一核酸的种类与功能核酸的种类与功能二二DNA复制原理复制原理三三PCR发展简史发展简史四四PCR基本原理基本原理五五PCR体系各组分及作用体系各组分及作用六六PCR操作步骤及分析操作步骤及分析七七PCR技术的优缺点技术的优缺点脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸核糖核酸核糖核酸核酸核酸 核酸是细胞内核酸是细胞内携带遗传信息的物质携带遗传信息的物质，在生物体的，在生物体的遗传、遗传、变异和蛋白质的生物合成变异和蛋白质的生物合成中起着极其重要的作用。中起着极其重要的作用。、种类、种类、功能、功能简称简称DNA简称简称RNA一一 核酸的种类与功能核酸的种类与功

2、能3、微生物分类、微生物分类（按核酸类型）按核酸类型）（1）DNA微生物：微生物：n 细菌、寄生虫类细菌、寄生虫类（附红细胞体、弓形体附红细胞体、弓形体）、衣原体、）、衣原体、支原体支原体n DNA病毒病毒 疱疹病毒科疱疹病毒科:伪狂犬病毒伪狂犬病毒、马立克病毒马立克病毒、传染性喉气管传染性喉气管 炎病毒和鸭瘟病毒；炎病毒和鸭瘟病毒； 圆环病毒科：圆环病毒科：猪圆环病毒猪圆环病毒、鸡传染性贫血病毒；、鸡传染性贫血病毒； 细小病毒科细小病毒科: 猪细小病毒猪细小病毒、犬细小病毒犬细小病毒、番鸭细小病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒；鹅细小病毒； 痘病毒科：鸡痘、山羊痘和绵羊痘；痘病毒科：鸡痘、山羊痘

3、和绵羊痘； 腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒腺病毒科：减蛋综合征病毒和犬传染性肝炎病毒（2）RNA微生物微生物nRNARNA病毒病毒 正粘病毒科：正粘病毒科：流感病毒流感病毒 副粘病毒科：副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫新城疫病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫 病毒病毒 弹状病毒科：弹状病毒科：狂犬病病毒狂犬病病毒、牛流行热病毒、牛流行热病毒 冠状病毒科：冠状病毒科：鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠猪传染性胃肠 炎病毒、猪炎病毒、猪 流行性腹泻病毒、流行性腹泻病毒、SARSVSARSV 黄病毒科：黄病毒科：猪瘟猪瘟、乙型脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒乙型脑

4、炎病毒、牛病毒性腹泻病毒 小核糖核酸病毒科小核糖核酸病毒科 ：口蹄疫病毒口蹄疫病毒 披膜病毒科披膜病毒科 ：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 双双RNARNA病毒：传染性法氏囊病毒病毒：传染性法氏囊病毒 反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒反转录病毒：禽白血病、牛白血病、马传染性贫血病毒二二 DNA复制原理复制原理n半保留复制半保留复制n19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：经过DNADNA变变性，与合适引物杂交，用性，与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可延伸引物，并不断重复该过程便可克隆克隆tRNAtR

5、NA基因。基因。n但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及7070年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，KhoranaKhorana的的设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了三三 PCR发展简史发展简史Kary B. Mullis (1944 -)，在在Cetus公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了PCR。 他原本是他原本是要合成要合成DNA引物来进行引物来进行测序工作，测序工作， 却常为没有却常为没有足够多的模板足够多的模板DNA而烦而烦恼。恼。1983年春夏之交的年春夏之交的一个晚上，他开车去乡一个晚上，他开车

6、去乡下别墅的路上萌发了用下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个两个引物（而不是一个引物）去扩增模板引物）去扩增模板DNA 的想法的想法.三三 PCR发展简史发展简史Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开的两条链，自己的车和对面开来的车象是来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA， n1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人发明了等人发明了聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）n基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制n最初采用最初采用E-

7、coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，由于该酶，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错n耐热耐热DNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCR能高效率的进能高效率的进行，随后行，随后PE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR自动自动化热循环仪化热循环仪n1993年，年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖三三 PCR发展简史发展简史四四 PCR基本原理基本原理n类似于类似于DNA的体内复制。的体内复制。n首先待扩增首先待扩增DNA模板加热变性解链，模板加热变性解链，n随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温

8、度随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，可使引物与它的靶序列发生退火，n再将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下聚合酶作用下得以延伸。得以延伸。n这种热变性这种热变性-复性复性-延伸的过程就是一个延伸的过程就是一个PCR循循环，环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断就是在合适条件下的这种循环的不断重复。重复。模板DNA95PCR原理PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本

9、原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍四四 PCR基本原理基本原理1

10、 1、PCRPCR体系组分体系组分n引物（引物（primer）n 酶酶 （Taq DNA polymerase） n dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） n模板模板 （template） nMg2+ （magnesium）五五 PCR体系各组分及作用体系各组分及作用（1）模板）模板 模板作为模板作为DNA合成时的合成时的初始链初始链，可以是，可以是DNA或或cDNA分子，分子，模板需要量一般为模板需要量一般为102105拷贝。拷贝。（2）扩增缓冲液）扩增缓冲液 缓冲液有助于缓冲液有助于酶的稳定酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。化反

11、应条件。1050mmol/L Tris-Hcl(pH8.38.8）（3）耐热）耐热DNA聚合酶聚合酶 催化催化PCR反应反应，该酶是从，该酶是从Thermus aquaticus细菌中提取的细菌中提取的特殊的耐热特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受聚合酶，可以耐受90以上的高温而不失活，以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；具有大降低了成本；具有 53方向的方向的聚合活性和外切活性聚合活性和外切活性。2 2、各要素作用、各要素作用五五 PCR体系各组分及作用体系各组分及作用美国美国 Yellowsto

12、ne 公园的公园的热泉热泉嗜热水生细菌嗜热水生细菌 Thermus aquaticus 1988年年saiki从嗜热水生菌从嗜热水生菌Thermus aquatics YT-1株株中直接分离出来。该菌株中直接分离出来。该菌株于于1969年从美国黄石国家年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离森林公园火山温泉中分离到。到。（4）4种种dNTP混合物混合物 四种脱氧核苷酸，是四种脱氧核苷酸，是DNA的原料的原料； dNTP的通常使用浓度的通常使用浓度为为20200mol/L。 （5）引物）引物 作为作为合成起始的识别点合成起始的识别点，从引物末端开始延伸，合成整，从引物末端开始延伸，合成整条链。通常

13、使用浓度为条链。通常使用浓度为（6）Mg2+ 与与dNTP以及以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶聚合酶识别；通常使用浓度为识别；通常使用浓度为 五五 PCR体系各组分及作用体系各组分及作用六六 PCR操作步骤与结果分析操作步骤与结果分析1、RNA/DNA提取提取2、RNA的反转录的反转录3、PCR扩增扩增4、电泳分析产物、电泳分析产物1、RNA/DNA提取提取（1）异硫氰酸胍法和异硫氰酸胍法和Trizol提取法提取法（RNA) （2）酚酚-氯仿提取法氯仿提取法和和DNAzol提取法提取法（DNA)（3）柱子提取法）柱子提取法（

14、4）全自动核酸提取法）全自动核酸提取法（1）Trizol提取提取RNA法：法：n取取1.5 mL 1.5 mL 灭菌灭菌Eppendorf Eppendorf 管，每管加入管，每管加入300 300 L L 裂解液，裂解液，然后分别加入待测样品、阴阳性对照各然后分别加入待测样品、阴阳性对照各100 100 L L，吸头反复，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）室温放置吸打混匀（一份样品换用一个吸头）室温放置2 2- -5min5min；再；再加入加入100 100 L L 氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于44条件下，条件下，12 000 r/mi

15、n 12 000 r/min 离心离心15 min15 min。nTrizolTrizol使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。n加入氯仿，有变性蛋白质的作用，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层。加入氯仿，有变性蛋白质的作用，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层。n吸取离心后各管中的上清液吸取离心后各管中的上清液150 150 L L转移至新的转移至新的1.5 mL 1.5 mL 灭灭菌菌Eppendorf Eppendorf 管中（注意不要吸出中间层，要缓慢出），管中（注意不要吸出中间层，要缓慢出），加入加入150150L L 20 20

16、预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min15min。n异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀核酸。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀核酸。（1）Trizol提取提取RNA法：法：n44条件下条件下12 000 r/min 12 000 r/min 离心离心15 min15 min（Eppendorf Eppendorf 管开管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地于吸水纸上，吸干液体，不同样品应置于吸水纸不同地方沾干。方沾干。n加入加入1 m

17、L 75%1 mL 75%乙醇，轻轻颠倒洗涤。乙醇，轻轻颠倒洗涤。44条件下条件下12 000 12 000 r/min r/min 离心离心5 min5 min（Eppendorf Eppendorf 管开口保持朝离心机转管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。n乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。(1)Trizol提取提取RNA法：法：n44条件下条件下12 000 r/min12 0

18、00 r/min离心离心30 s30 s，将管壁上的残余液体，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头（注意：滴头勿接触沉淀），真空抽干一个吸头（注意：滴头勿接触沉淀），真空抽干3 3 - -5 min5 min或室温干燥或室温干燥10 min10 min。不宜过于干燥，以免。不宜过于干燥，以免RNARNA不溶。不溶。n加入加入11 11 L DEPC L DEPC 水，轻轻吹打混匀，溶解管壁上的水，轻轻吹打混匀，溶解管壁上的RNARNA，2 000 r/min 2 000 r/min 离心离心5 s5 s，

19、冰上保存备用。提取的，冰上保存备用。提取的RNARNA须在须在2 2 h h 内进行内进行RT-PCR RT-PCR 扩增或放置于扩增或放置于 70 70 冰箱备用。冰箱备用。注意事项注意事项nRNARNA提取时，提取时，要戴口罩、手套要戴口罩、手套，所用，所用EPEP管、滴头及相关容器等要清洁，用管、滴头及相关容器等要清洁，用0.1% DEPC0.1% DEPC水处理水处理12h12h以上再经高压处理以上再经高压处理, ,烘干后方可使用。要有专用操作台烘干后方可使用。要有专用操作台（在（在超净工作台或生物安全柜超净工作台或生物安全柜进行操作）。进行操作）。n所有试剂应在规定的温度储存，使用后

20、立即放回。所有试剂应在规定的温度储存，使用后立即放回。 异丙醇异丙醇和和75%75%乙醇要放在乙醇要放在2020 预冷预冷。n加样和混匀时一份样品要加样和混匀时一份样品要换用一个吸头换用一个吸头，不同样品加同一试剂时吸头要悬空，不同样品加同一试剂时吸头要悬空加入，避免交叉污染。加入，避免交叉污染。n加入加入TrizolTrizol试剂后要试剂后要作用一定时间作用一定时间（5min5min），使其充分裂解释放），使其充分裂解释放RNARNA。n吸取水相吸取水相RNARNA时，时，要避免吸到中间液面（蛋白质层），要避免吸到中间液面（蛋白质层），从而保证从而保证RNARNA纯度。纯度。n要小心、细致

21、、晃动及每次移液要轻。这样做的目的：一是小心要小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的目的：一是小心RNaseRNase的污染的污染降解降解RNARNA；二是动作过大会破坏；二是动作过大会破坏RNARNA的完整性。的完整性。n要勤换手套，操作过程速度要快。要勤换手套，操作过程速度要快。 (2)DNA提取提取样品采集：取病死或扑杀的动物组织；活体动物可取血清、样品采集：取病死或扑杀的动物组织；活体动物可取血清、咽喉或鼻腔拭子。咽喉或鼻腔拭子。 样品处理：每份样品分别处理样品处理：每份样品分别处理 组织样品处理：称取待检病料组织样品处理：称取待检病料0.2g0.2g置组织研磨器中剪碎并置组织研磨器

22、中剪碎并研磨，加入研磨，加入600600L L 裂解液裂解液继续研磨。取已研磨好的待检病料离继续研磨。取已研磨好的待检病料离心后取上清心后取上清100100L L加入加入1.5 mL1.5 mL灭菌离心管中，再加入灭菌离心管中，再加入500500L L 裂裂解液解液和和1010L L 蛋白酶蛋白酶K K，混匀后，置，混匀后，置5555水浴中水浴中30min30min1h1h。 全血样品全血样品/ /咽喉或鼻腔拭子的处理：血凝后，咽喉或鼻腔拭子的处理：血凝后，8 000 rpm8 000 rpm离离心心5 5 minmin，取血清，取血清100100L L；咽喉或鼻腔拭子向其中加入；咽喉或鼻腔拭

23、子向其中加入300300500500L L 的的PBSPBS混悬液，混悬液，10 000 rpm10 000 rpm离心离心5 5 minmin，取上清，取上清100100L L；加入加入500500L L 裂解液裂解液和和1010L L 蛋白酶蛋白酶K K，混匀后，置，混匀后，置5555水浴中水浴中30min30min1h1h。裂解液使组织变性，释放裂解液使组织变性，释放DNADNA。蛋白酶。蛋白酶K K主要降解组织中的天然蛋白。主要降解组织中的天然蛋白。(2)DNA提取提取 样品样品DNADNA的抽提的抽提n自水浴锅中取出已处理的样品，加自水浴锅中取出已处理的样品，加500500L L 酚

24、酚- -氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇( (用之前不要晃用之前不要晃动，不要吸到上层保护液动，不要吸到上层保护液) )，颠倒混匀，颠倒混匀，12000rpm12000rpm离心离心10min10min。酚酚- -氯仿氯仿- -异戊醇，使异戊醇，使DNADNA从组织中游离到水相，与蛋白分开。从组织中游离到水相，与蛋白分开。n取约取约500500L L上清置于灭菌离心管中，加入上清置于灭菌离心管中，加入500500L L 异丙醇，混匀，室温沉淀异丙醇，混匀，室温沉淀10-20min10-20min。异丙醇主要沉淀异丙醇主要沉淀DNADNA。n取出样品管，取出样品管，13 000 rpm13 000 r

25、pm离心离心15min15min。n 弃上清，加入弃上清，加入700700L 70%L 70%乙醇，轻弹管壁以使沉淀充分悬浮，乙醇，轻弹管壁以使沉淀充分悬浮，12000 rpm12000 rpm离心离心5min5min，弃上清，将离心管倒扣于吸水纸上，弃上清，将离心管倒扣于吸水纸上1min1min以吸干残液或以吸干残液或10000rpm10000rpm空离空离30sec30sec后用移液器吸去残液（注意：滴头勿接触沉淀），再将离心管后用移液器吸去残液（注意：滴头勿接触沉淀），再将离心管5050烘干或真空抽干烘干或真空抽干15min(15min(以无乙醇味为准以无乙醇味为准) )。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白。n取出样品管，用取出样品管，用10-2010-20L L 灭菌的去离子水溶解沉淀，作为模板灭菌的去离子水溶解沉淀，作为模板DNADNA备用。备用。32全自动提取核酸全自动提取核酸,实现自动化实现自动化,提高了提高了RNA提提取效率和纯度，适合高通量检测取效率和纯度，适合高通量检测（32份样品，份样品，时间时间35mi