捷安肽素抗真菌作用机理研究

1、捷安肽素抗真菌作用机理研究【摘要】目的研究捷安肽素的抗真菌作用机理。方法 采用形态学方法和同位素标记法。显微形态观察经捷安肽素处理后的供试真菌的形态学变化。进一 步采用14c同位素标记的特异底物“尿昔二磷酸(140 葡萄糖”示踪，研究 捷安肽索对真菌聚糖合成酶活性反应的影响。结果显微形态观察 表明，经捷安肽素处理后，供试真菌呈现球形膨胀，而且随着捷安肽素作用强度 增强，球形膨胀的程度和发牛频率也增加，提示捷安肽素的作用位点在真菌细胞 壁。同位素标记实验表明，捷安肽素可抑制(1,3)葡聚糖合成酶的活性,降低真菌细胞壁合成过程屮(1,3)-葡聚糖的放射性掺入，对疫霉菌和辣椒炭疽病菌(b3)-3-d

2、-®聚糖合成酶的抑制率分别达到77.7%和77.5%。结论 捷安肽素的抗真菌作用机理为：抑制细胞(1,3)葡聚糖合成酶的活性，破坏真菌细胞壁的合成，造成真菌细胞琏组分(1,3) 葡聚糖的缺损和病 原真菌生长抑制。【关键词】 捷安肽索；抗真菌作用机理；(b3) -p-d-葡聚糖合成酶a research on mechanism of antifungal polypeptide jiean-peptidedai fu-yingbzhou jirvyon2jan hong2(1 .depa 什 merit of pathoge nic biology,chengdu medical c

3、ollege,chengdu 610083； 2.chengdu institute of biology,cas,chengdu 610041)abstract： objective to investigate the ontifungal mechqnism of jiean-peptide.methods the mode of action of jiean-peptide against 4 phytopathogenic filamentous fungi associated with phytopathy:phytophthora sp.zcolletotrichum gos

4、sypii,southw botrytis cinerea and fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was investigated by the method of morphology and isotope labelling.the (1 z3)-3-d-glucon synthase assay was processed using isotope labelled substrateurdine diphosphate(14c)glucose to study the effect of jiean-peptide on fungal(l

5、,3)-3-d-glue on synthase.results micrographic observati on revealed that the jiean-peptide made the hyphal expanded and globular.the(l z3)-3-d-glucan synthose assay showed jieon-peptide could inhibit the activity of(lz3)-p>-d-glucan synthose and reduce the radioactivity in corporation of(l ,3)-3-

6、d glucon.the inhib 帀on perce ntoges of jieon-peptide agai nst phytophthora spend colletotrichum gossypii southw were 77.7% and 77.5% respectively.conclusion the antifungal mechanism of jiean-peptide was the inhibition of enzyme activity of(l z3)-p>-d-glucan synthase.key words:jiean-peptide； antif

7、ungal mechanism； (1 z3)-3-d-glucansynthase捷安肽素是一种由芽抱杆菌产生的抗真菌活性多肽，具有广谱抗真菌活 性，而且稳定性好、抑菌持久，具有很好的开发前景1, 2。从捷安肽素对疫 霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多种常见重要植物病原真菌的抑 菌性能可知，捷安肽素可以通过抑制真菌抱了萌发、菌丝生长而发挥抗真菌生长 作用。形态观察发现，捷安肽素可以破坏真菌的细胞壁结构，使真菌细胞呈现原 生质球状3°(1,3)bd-葡聚糖合成酶(ec2.4.1.34；尿营二磷酸葡萄糖/(1,3)- 葡聚糖葡糖基转移酶)是一细胞膜结合酶，在细胞膜内侧聚合ud

8、pg 形成葡聚糖纤维，葡聚糖纤维分泌出细胞膜形成网状支架，对真菌细胞壁的完整 性及保护真菌抵抗低渗透压起重要作用4, 5。本文作者采用形态学方法和同 位素标记法研究捷安肽素对真菌细胞壁及其(1,3)bd葡聚糖合成酶的作用, 进一步深入探讨捷安肽素的抗真菌作用机理，为捷安肽素的进一步开发提供理论 基础。1材料1.1菌种疫霉菌(phytophthora sp.)、辣椒炭疽病菌(colletotrichum gossypii southw)、灰霉菌(botrytis cineeo)、棉花枯萎病菌(fusorium oxysporum f.sp.vasinfectum),均为木实验室保藏菌种。1.2培

9、养基马铃薯葡萄糖液体培养基。1.3主耍试剂捷安肽素原液(生物效价为19.5 mm)由本实验室提供；尿昔二磷酸(140 葡萄糖udp- ( 140 -g, perkin-elmer 进口 产品；2,5二苯基 卩坐 (2z5-di-phenyloxazolezppo), fisher进口产品。(捷安肽素的生物效价采用 管碟法2测定，以疫霉菌为检验菌株，以抑菌圈直径为效价指标)。1.4主要溶液粗酶提取缓冲液 5x 10-2mol/l tris-hci ph7.5jmol/l 葡萄糖,1 x 10-3mol/l edta, 5x10-3mol/l mgclzl x 10-2mol/l nqf,层析展开

10、剂 95% 乙醇j mol冰醋酸(7 : 3, v/v) 烁液1 g ppo, 200 ml甲苯。1.5主要仪器shz-82大容量回旋振荡器 德国zaiss.axioplan2型多功能显微 镜,phs3精密数显酸度计sigma 3k30高速冷冻离心机zfj-353g1型双道液体闪烁计数器等。2方法2.1捷安肽素作用下供试菌的形态观察将疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌接种于马铃萼液体培养基 (终砲子浓度为106个/ml), 25°c150 r/min振荡培养48 h。每隔2 h取样，用 0.05%的乳酚蓝染色液对样品进行固定、染色、显微观察砲子萌发情况和菌丝生 长情况。设置3

11、个实验组，捷安肽素的处理浓度分别为原液浓度、1/2原液浓度 和空口对照。2.2捷安肽索样品的处理将捷安肽素样品分为两组，组i不做任何处理，生物效价为19.5 mm；组ii 用30%的nooh调ph为10,再以15%的hci调ph为7.5,生物效价为零。2.3制备(1,3) bd葡聚糖合成酶粗酶液分别接种疫霉菌和辣椒炭疽病菌于马铃薯葡萄糖液体培养基屮，疫霉菌30 °c. 150 r/min振荡培养30 h；辣椒炭疽病菌25°c. 150 r/min振荡培养36h, 收集培养液，离心洗涤获得菌丝体。(1,3)聚糖合成酶粗酶液的制备采用文献6的方法，经适当改进。液氮研磨菌丝体后加

12、入粗酶提取缓冲液，充 分振荡泯匀于4°c、3 500g离心10 min。收集上清夜,再将上清液于4°c、50 000g 离心45 min。所得沉淀为粗酶制品，悬浮于503x 10-3mol/l tris-hcl ph 7.5(含 33%的甘油)中，用bradford法测定酶蛋白含量，蛋白浓度控制在35 ng/ i,于70°c保存备用。2.4 (1,3)bd葡聚糖合成酶粗酶的活性测定采用14c标记的特异底物udpg,与(b3)-3-d-®聚糖合成酶进行酶反应，闪烁计数检测反应产物 葡聚糖的放射性，确定(b3)-f3-d-j聚糖合成酶粗酶液的活性。2.4.1

13、 葡聚糖合成酶反应7反应体系 40 u i,包括 253x 10-3mol/l tris-hci ph7.5,0.5 mol/l 葡萄糖, 103x 10-3mol/l nafz5 mg/ml bsa740 bq udp(14c)g 和 10 n 1(1,3)- bd葡聚糖合成酶粗酶液。以加入10 口丨双蒸水的反应组作为(1z3)-p-d-葡聚 糖合成酶粗酶液的空白对照组，以加入10 ul沸水浴30 min灭活的粗酶液的反 应组作为葡聚糖合成酶粗酶液的阴性对照组。每组反应重复2次。反 应系统于30°c保温30 min,最后加入4 口丨冰乙酸终止反应。2.4.2 (1,3)- bd葡聚

14、糖合成酶反应产物的分离和放射性测定 反应终 止后，按文献8的方法进行反应产物的分离。将反应液点样于新华3号滤纸 上，下行层析过夜。取出滤纸风干，剪下原点，于fj-353g1型双道液体闪烁计 数器测定每分钟闪烁次数（cpm）,表示同位素标记的葡聚糖的放射 性强度，并以此衡量葡聚糖合成酶的活性。fj-353g1型双道液体闪 烁计数器对c14探测效率大于70%；闪烁液放射本底小丁 60次/min。2.5捷安肽素对（1,3） -p-d-葡聚糖合成酶反应的影响 按2.3方法进 行捷安肽索影响下的（b3）-f3-d-葡聚糖合成酶反应和产物分离与放射性检测。反 应设置3组：捷安肽素处理组i、捷安肽素处理组i

15、i和捷安肽素空白对照组iii。 实验中捷安肽索或双蒸水加样量均为2111,每组重复10次。根据反应产物的放 射性计算产物的放射性掺入率和捷安肽素对酶反应的抑制率。掺入率二处理组产 物放射性/对照组产物放射性x 100%,抑制率二1-掺入率。2.6数据处理采用统计分析软件spss 11.5进行数据的单i大i素方差分析。3结果与分析3.1捷安肽索对各病原菌形态的影响光学显微镜观察捷安肽素作用下各病原真菌的菌丝和砲子形态（0.05%的乳 酚蓝染色液染色），可见供试真菌的抱了和菌丝形态有显著的变化，孑包了和菌丝 体膨大、畸形、原生质凝聚、砲子不萌发或萌发异常、菌丝上产生大量球形膨胀 泡囊、生心受阻。随

16、着捷安肽素处理的时间增长或浓度加大这种球形膨胀的程度 和发生频率也増大。图1所示为培养24h的供试病原真菌,捷安肽素处理浓度为 1/2原液浓度，其小对照菌丝表而光滑、结构完整，处理菌丝均呈现不同程度的 球形膨胀。众所周知，真菌的细胞壁是细胞规范和维持形态所必需的，一旦细胞 壁受损，细胞的原生质体在胞内渗透压的作用下，便会形成球状。由此推测捷安 肽素破坏了供试真菌的细胞壁，从而使之呈现球形膨胀。3.2 （1,3） -p -d葡聚糖合成酶粗酶液的制备和活性 采用2.3方法制 备出疫霉菌和辣椒炭疽病菌菌丝的（1,3）-葡聚糖合成酶粗酶液，经检验该（1,3）葡聚糖合成酶粗酶液的阴性对照组与空白对照组结

17、果和同，反应产物的放射性均小t60cpm,为闪烁液本底值，没有酶活；实验组反应产物 的放射性为3 0005 000 cpm,表明（1,3）bd葡聚糖合成酶粗酶具有催化 活性，可用于进一步的实验。3.3捷安肽素对（1,3）葡聚糖合成酶反应的影响按照方法2.5,采用14c同位素标记的特异底物“udp-（14c）-g”示踪，用捷安肽素处理（1,3） 葡聚糖合成酶反应，测定反应产物（1,3） 葡聚糖的放射性。结果表 明疫霉菌(1,3) bd葡聚糖合成酶反应中，处理组i、ii的放射性掺入(空 白对照)分别为22.3%±2.8%# 96.0%±0.8%；辣椒炭疽病菌(1,3) 葡 聚糖

18、合成酶反应中，处理组i、ii的放射性掺入(空白对照)分别为22.5%± 2.5%和747%±30%,见图2。图2捷安肽索对(1,3)聚糖放射性掺入的影响fig.2 the effects of jiean-peptide on(lz3)-3-dglucorts radioactive in corporation如图2所示，在疫霉菌和辣椒炭疽病菌的(1,3) -p-d-葡聚糖合成酶反应 屮，捷安肽素处理组i、ii的放射性掺入均低于空白对照组iii,但其各自的组间 差异不同。进一步采用统计分析软件spss 11.5对数据进行单因素方差分析，比 较组间差异是否显著，结果见表1和

19、表2。表1捷安肽素对疫霉菌(1,3) d-葡聚糖合成酶的影响从表1可知，疫霉菌(1,3)葡聚糖合成酶反应中,捷安肽素处理组i和处理组i【z间、捷安肽素处理组i和空白对照组iiiz间均差 异显著(pl<0.0bp2<0.0bn=10),处理组ii和空白对照组iii之间差异不显著 (p3>0.05,n=10),表明捷安肽索处理组i可抑制反应产物的放射性掺入，抑 制率为77.7%±28%；捷安肽素处理组ii不能抑制反应产物的放射性掺入，抑 制率4%±0.8%属于实验误差，不具有统计意义。表2捷安肽素对辣椒炭疽病 菌(13) -p-d-ffi聚糖合成酶的影响从表2

20、可知,辣椒炭疽病菌(l3) -0-d- 葡聚糖合成酶反应屮，捷安肽素处理组i、处理组ii、空白对照组iii相互z间均 差异显著(pk0.01, p2<0.0lp3<0.01zn=10),表明捷安肽素处理组i和捷 安肽素处理组ii均可抑制反应产物的放射性掺入，抑制率分别为77.5%±2.5% 和 25.3%±3.0%。在木实验中，捷安肽素处理组i (效价为19.5mm)对辣椒炭疽病菌和疫霉菌 的(1,3)葡聚糖合成酶均具有抑制作用，这与它拥有生物活性的特性相一致。而捷安肽素处理组ii的效价为零，即没有生物活性，但它对辣椒炭疽病菌 的(1,3)葡聚糖合成酶却表现出了

21、抑制作用。分析原因可能是因为捷安肽素的生物效价测试菌为疫霉菌，捷安肽素无生物活性只是相对疫霉菌而言。而 辣椒炭疽病菌对捷安肽素的敏感性不如疫霉菌对捷安肽素的敏感性高3,所以 对于同一浓度捷安肽素处理ii,辣椒炭疽病菌的酶反应受抑，疫霉菌的酶反应不 受抑制。4讨论随着现代科学技术的迅速发展，放射性核素正广泛地应用于生物学、医学和 农学等学科的各个领域，大大地推动这些学科进入分子水平的新阶段。猶的放射 性分析方法9即是采用放射性标记底物与酶液在适宜的条件下保温-段时间 后，分离、测定酶催化底物所生成的产物的放射性而确定酶活性，是生物研究中 最常用的方法。其它细胞壁相关酶类的分析法包括生物化学法、原

22、位分析法、荧 光染色等，但都不如放射性分析方法灵敏、快速、简便。因此，本实验采用酶的 放射性分析方法研究捷安肽素的抗真菌作用机理：从疫霉菌和辣椒炭疽病菌屮提 取细胞壁合成中重要的(1,3) bd-葡聚糖合成酶，采用14c放射性标记的特 异底物“尿首二磷酸-(140 葡萄糖”示踪，研究捷安肽素对(1,3)-bd葡聚 糖合成酶活性的影响。已知抗真菌多肽的作用机理主要有两种10： 种是干扰真菌的细胞壁组 分葡聚糖、几丁质和各种甘露蛋口的合成，导致细胞壁的缺损。如棘白霉素类化 合物能结合b-1,3-d-葡聚糖合成酶复合体的fksp亚基而干扰b-1,3d葡聚糖的 合成，发挥抗真菌作用11。另-种是在细胞

23、膜上形成电势依赖的或其它的通 道，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄露。陈刚、裴炎等通过检测抗真菌多 肽aps对脂质平而膜电学性质的影响发现aps可在细胞膜上持续形成孔道 (pores),破坏膜的完整性，引起细胞内容物的外流，最终导致真菌的死亡12。 木实验研究发现，捷安肽素可使疫霉菌和辣椒炭疽病菌的b葡聚糖合成酶的反应产物的放射性掺入率降低。由此推测捷安肽素可能的抗真菌机理是：抑 制真菌(1,3)葡聚糖合成酶活性，造成真菌细胞壁组分(1,3) -p-d-葡聚糖的缺损，破坏真菌细胞壁的完整性，造成病原真菌生长抑制。真菌的细胞壁 合成是一个非常复杂的过程，涉及许多酶类13,捷安肽索对真菌细胞壁合

24、成 相关的其它酶类如几丁质合成酶等的酶活性有无作用还有待进一步研究。植物真菌病害是口前较难防治的农作物病害，一直制约着农业经济的发展。 而过度地人量使用化学农药，已造成了全球生态环境的不断恶化及粮食危机，发 展无公害生物农药已是大势所趋。捷安肽素抗真菌作用机理的初步阐明，有助于 捷安肽素作用机理的更深层次的研究，冇助丁建立农用抗菌素的筛选模型、利用 分子设计手段进行分子的改造和新的抗菌物质的合成，同时为捷安肽素开发为新 型生物农药提供生产、制剂、使用等方面的理论依据。同时，因为动物细胞没有 细胞壁，捷安肽索对真菌细胞壁合成的抑制作用，为捷安肽索向人药发展提供了 可能。【参考文献】1 zhong

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