识别和鉴定稻瘟病菌在植物中表达的诱发水稻细胞死亡的分泌效应蛋白

1、识别和鉴定稻瘟菌在植物中表达的诱发水稻细胞死亡的分泌效应蛋白Songbiao Chen,1,2,3 Pattavipha Songkumarn,2 R. C. Venu,2 Malali Gowda,2 Maria Bellizzi,2 Jinnan Hu,2Wende Liu,1 Daniel Ebbole,4 Blake Meyers,5 Thomas Mitchell,2 and Guo-Liang Wang1,21. 中国农业科学院，植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京，100193;2. 美国俄亥俄州立大学，植物病理学系，哥伦布，OH 432103. 中国福建省农业科

2、学院研究院，生物技术研究所，福州，3500034. 美国德州农工大学，植物病理学和微生物学系，学院站，TX 790165. 美国特拉华大学，特拉华生物技术研究所，新泽西州纽瓦克市，DE摘要 水稻和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)之间的互作涉及到识别细胞的组成成分及两者之间复杂的分子信号交流。这些相互作用在水稻细胞中是怎样发生仍然十分难懂。我们采用基因表达的高通量序列分析技术，进行大规模平行信号测序，并通过合成测序来检查受感染的水稻叶片的转录组概况。总共有6413个在植物中表达的真菌基因，其中包括851个基因编码的预测效应蛋白，被确定。我们使用了原生质体的瞬时表达系统来评估42个

3、预测效应蛋白的诱导植物细胞死亡的能力。异位表达测定确认存在五个新型的效应子，当它们拥有用于分泌到胞外空间的信号肽时可引起宿主细胞的死亡。其中四个在本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)中能诱导细胞死亡。尽管五个效应都在其序列中表现出高度多样化，但是诱导每个细胞死亡的生理基础是相似的。这项研究表明，我们的综合基因组方法能够有效的识别在稻瘟病菌在植物中表达的细胞死亡诱导效应，这种效应可能起着重要的作用，促进感染过程中定植与真菌生长。关键词 分类号 Identification and Characterization of In plantaExpressed Secreted

4、 Effector Proteinsfrom Magnaporthe oryzae That Induce Cell Death in Rice. Songbiao Chen,1,2,3 Pattavipha Songkumarn,2 R. C. Venu,2 Malali Gowda,2 Maria Bellizzi,2 Jinnan Hu,2Wende Liu,1 Daniel Ebbole,4 Blake Meyers,5 Thomas Mitchell,2 and Guo-Liang Wang1,2（1.State Laboratory for Biology of Plant Dis

5、eases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Department of Plant Pathology, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, U.S.A.; 3.Biotechnology Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou,Fujian35

6、0003, China;4.Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University, College Station,TX 79016, U.S.A.; 5. Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware, Newark, DE, U.S.A. ）Interactions between rice and Magnaporthe oryzae involve the recognition of cellular components a

7、nd the exchange of complex molecular signals from both partners. How these interactions occur in rice cells is still elusive. We employed robust-long serial analysis of gene expression, massively parallel signature sequencing, and sequencing by synthesis to examine transcriptome profiles of infected

8、 rice leaves. A total of 6,413 in plantaexpressed fungal genes, including 851 genes encoding predicted effector proteins, were identified. We used a protoplast transient expression system to assess 42 of the predicted effector proteins for the ability to induce plant cell death. Ectopic expression a

9、ssays identified five novel effectors that induced host cell death only when they contained the signal peptide for secretion to the extracellular space. Four of them induced cell death in Nicotiana benthamiana. Although the five effectors are highly diverse in their sequences, the physiological basi

10、s of cell death induced by each was similar. This study demonstrates that our integrative genomic approach is effective for the identification of in plantaexpressed cell deathinducing effectors from M. oryzae that may play an important role facilitating colonization and fungal growth during infectio

11、n.在自然界中，植物与其病原的协同进化导致双方都演变出一组策略用来攻击和防御。植物病原体可首先使用细胞壁降解酶以消化细胞壁的表面层，以便于侵入。成功的致病菌能够分泌多种细胞外分子以破坏宿主的防御机制。这些细胞外分子包括质外体效应物，如毒力因子，毒素和充当关键毒力因子抑制宿主防御的降解酶（Hogenhout等，2009年）。另一方面，植物进化出独特的机制来保卫自己，例如使用物理屏障，抗微生物化合物，和先天免疫系统。植物免疫系统包含两重(Chisholm 等. 2006; Jones 和 Dangl 2006)。植物的第一重免疫的发起是通过宿主与膜相关的构型识别受体（PRR）来感知病原体或微生物相

12、关的分子模式(PAMPs 或 MAMPs)，这会引起植物的基础防御反应，称为PAMP触发免疫（Zhang 和 Zhou 2010）。第二重免疫的发起是通过同源抗性蛋白识别出所述无毒效应物，并快速激活超敏反应（HR），这会导致强烈的小种专化抗病性称为效应子触发的免疫。在过去十年中，大量的研究都指向许多PAMP及其无毒效应物在植物病原菌和PRR和R蛋白在植物中的识别(Dodds等.2009)。其中大部分良好表征的效应分子是来自于采用的III型分泌系统，直接递送效应物引入宿主细胞的原核细菌中。与细菌不同，真菌和卵菌纲致病菌往往通过真核生物分泌途径（Panstruga 和 Dodds 2009）向细胞

13、外环境分泌效应蛋白。在基因组测序技术的最新发展使得卵菌纲致病菌中众多的效应物迅速被发现，并在他们的结构和功能方面提供了丰富的信息。例如，大豆疫霉根腐病和P. ramorum基因组的分析导致保守结构域RXLR和dEER的发现(Tyler 等. 2006)，这对于将卵菌纲效应物的易位到植物细胞中是必要的（Dou 等. 2008a; Whisson 等. 2007）。RXLR蛋白大家族的预测，这为卵菌纲效应的活动功能研究提供了丰富备选。然而，由真菌导出的分泌蛋白似乎缺乏这种保守结构域，并我们对于其功能知之甚少。这种半活体寄生真菌稻瘟病菌是水稻稻瘟病的病原，是最具破坏性的疾病，影响全世界水稻的生产（D

14、ean 等. 2005; Ebbole 2007;Talbot 2003）。在稻瘟病菌中，有更多的基因（多达1,306），这种鉴定的分泌蛋白的编码序列已经从一个实验室菌株的基因组中被预测，70-15(Dean 等. 2005; Yoshida等. 2009)。七个分泌性蛋白即PWL1, PWL2 (Kang 等. 1995; Sweigard 等. 1995), AvrPita(Orbach等2000), Avr-Pia, Avr-Pii, Avr-Pik/km/kp(Yoshida等. 2009), and AvrPiz-t (Li等. 2009)已被确认为无毒（AVR）的蛋白质，由相应的抗

15、性基因产物推测认可。此外，一些分泌性蛋白对于致病性来说是必需的，即MPG1 (Talbot等1993), EMP1 (Ahn等. 2004), MHP1(Kim等. 2005), MSP1 (Jeong等. 2007), MC69 (Saitoh等. 2012), and Slp1 (Mentlak等. 2012), 和四个活体营养相关的分泌性蛋白BAS1 到BAS4 (Mosquera等.2009)也被鉴定。然而，大多数稻瘟病菌的分泌性蛋白在致病性的功能没有相关的实验进行测试。 为了识别稻瘟病菌的基因编码预测重度感病的叶片组织中分泌蛋白的表达，我们开发了一个综合的基因组表达图谱方法，包括高通

16、量基因分析技术 (RL-SAGE) (Gowda 等. 2004)，大规模平行信号测序(MPSS) (Brenner等. 2000;以及合成法测序(SBS)(German等l. 2008; Venu等. 2011a)。受感染的组织是从6个时间点收集，以便在后期感染阶段真菌转录在植物中的表达可以包含在库中。我们使用了原生质体瞬时表达分析，以确定稻瘟菌在植物中表达的分泌的蛋白诱导水稻的细胞死亡。在42个蛋白质测试之中，5个诱导细胞死亡的蛋白是功能特性蛋白。这里所描述的综合方法提供了用于真菌细胞死亡诱导蛋白功能鉴定的一种有效的策略，这涉及植物和真菌的相互作用。1结果 1.1 重度感病的水稻叶片基因表

17、达谱分析。为获得稻瘟菌与水稻亲和与不亲和的相互作用的过程中更为全面的基因表达谱，我们构建1个RL-SAGE，11个 MPSS，和7个SBS库进行深度测序。RL-SAGE库是在水稻叶片接种亲和的隔离种群Che86061，在接种后96个小时（hpi）产生的 (图.1A)。一共从库中获得了18154个显著特征。其中，有3105（17.1）个显著特征和12263（67.5）个显著特征分别匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。不匹配的特征可能是由于测序错误或分布在两个基因组测序的间隙。只有14个特征与稻瘟病菌和稻的基因组都匹配，这表示大部分特征都是基因组专用的。我们确定了3091个特征明确地匹配稻瘟病菌的基因组，

18、它们与3000个之前注明的稻瘟病菌的基因相对应。11个 MPSS库从野生型日本晴水稻或转基因日本晴水稻携带的抗稻瘟病基因Pi9 (Qu 等. 2006)的叶片中产生的，其接种稻瘟菌在亲和(3, 6, 12, 24, 48,和 96 hpi)或不亲和(3, 6, 12, 24,和 48 hpi)的相互作用中找出KJ201（图1A）。正如预期的那样，在不亲和的相互作用相比，更多个特征码匹配到稻瘟病基因组中的亲和相互作用。从五个不亲和的相互作用MPSS库中共获得了57671个显著特征。其中，有724（1.2）个显著特征和38024（65.9）个显著特征分别唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。从六个亲和

19、的相互作用库，总共获得了63132个显著特征。其中，有2545（4）个显著特征和41784（66.1）个显著特征分别唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。总共有3216个注明的稻瘟病菌基因被同时从亲和和不亲和的MPSS库中鉴定。相同的叶片组织用于产生MPSS库（亲和相互作用在6，12，24，和96 hpi,并在不亲和的相互作用6，12，和24 hpi）和七个SBS库的构建（图1A）。从三个不亲和的相互作用的SBS库中一共获得了65299个显著特征码。其中，3492（5.3）个显著特征和49706（76.1）个显著特征分别专门匹配于稻瘟病菌的基因组和水稻基因组。从四个亲和相互作用SBS库中一共获得了

20、68825个显著特征。特征相匹配的的稻瘟病菌基因组有5283（7.7）个，且那些匹配水稻基因组共有50756（73.7）个。来自亲和和不亲和的相互作用的SBS特征一起确定了4,781个已注明的稻瘟病菌的基因。总而言之，在三种表达谱技术的作用下，一共有6413个稻瘟病菌在感染过程表达的已注明的基因被确定（图1A）。1.2 鉴定基因编码1.2.1 假定分泌蛋白在感染过程中的表达众所周知分泌性蛋白在真菌与植物的相互作用中发挥着重要的作用(Rep 2005; Zhang and Zhou 2010)。因此，我们重点放在在上述转录库中确定的分泌蛋白基因的分析。为了从在植物中表达的基因集合中获得最确切的分

21、泌蛋白基因序列，我们用了两个稻瘟病菌分泌蛋白的数据集，一个是Dean和同事（2005）（简称数据集I），另一个由Choi和同事（2010）（简称为数据集），参考为人工标注。共有851个截然不同的分泌蛋白基因从两个数据集中被确定（图1A，补充表S1）。在大约有85.7（264/308）个在数据集I发现的分泌蛋白基因也存在于数据集II中（图1E）。在RL-SAGE, MPSS, 和SBS这三个库中，用在相同的时间点从稻叶接种亲和分离菌为材料（96 hpi）（RL-SAGE-96h，MPSS-96h，SBS-96 h），与两个数据集I和II以及其他两个库相比，超过两倍以上分泌蛋白基因从SBS-96h

22、库中被确定（图1C和D）。图.1 稻瘟病菌与水稻互作过程中的基因表达分析。A, 通过高通量基因分析技术 (RL-SAGE)，大规模平行信号测序(MPSS)以及合成法测序(SBS)进行基因表达谱的汇总统计，并确定在植物中表达的稻瘟病菌的基因编码的推定分泌蛋白。B, 分别从RL-SAGE-96小时， MPSS-96小时，和SBS-96小时库中鉴定出的所有稻瘟病菌基因的聚类分析。C, 从数据集I(Dean 等. 2005)中回收的假定的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。分别在RL-SAGE-96小时， MPSS-96小时，和SBS-96小时。D, 从数据集II (Dean 等. 2005) 中回收的假定

23、的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。分别在RL-SAGE-96小时， MPSS-96小时，和SBS-96小时。E, 分别从数据集I和数据集II中回收的所有时间点库中的假定稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。为了对在植物中表达的分泌蛋白在水稻和稻瘟菌相互作用中的功能进行更深入的了解，我们进行了以基因本体（GO）为基础的分类。以这种分类方法分析显示，大多数在植物中表达的分泌蛋白与代谢过程有关，接着是发育过程，细胞代谢过程，和多细胞有机体处理（图2A）。对于分子功能，大多数在植物中表达的分泌蛋白与催化活性和结合相关（图2B）。图2.基因本体论（GO）标注在植物中表达的稻瘟病菌的假定分泌蛋白。 A，基于生物学过

24、程分类。B，基于分子功能分类。1.3 瞬时表达分析确定了五个稻瘟菌的质外体效应能水稻细胞中诱导细胞死亡。宿主细胞死亡是在植物-病原体相互作用中的一种普遍存在的特征。为了确定稻瘟菌分泌的蛋白质参与了宿主细胞死亡，我们使用我们建立的方法，进行了对稻瘟菌分泌的蛋白质在水稻原生质瞬时表达（Chen等，2006）。在试验中，细胞的死亡被监控通过感染-葡萄糖醛酸酶基因在水稻原生质中减少的表达水平来表示(图.3A) (Dou等. 2008b; Jia等. 2000; Mindrinos等. 1994; Yoshida等. 2009).。为了瞬时表达检测，共有42个分泌蛋白基因被克隆（补充表S2）。对于每一个

25、选择的基因，都构建了两种版本基因转染的质粒，一种含全长的开放读码框(ORF)（称为FL），另一个则包含截断的编码区，没有信号肽的序列，但具有工程改造ATG起始密码子（称为NS）。瞬时测定法显示，在FL版本的42个分泌蛋白基因中有5个能够在水稻原生质表达时，引起的一个显著降低GUS活性（图3B），这表明这些5种蛋白在水稻细胞中可诱导水稻细胞的死亡。另一方面，NS版本的42个检测基因瞬时表达没有导致细胞活力的任何降低。因此，我们所指的5个分泌蛋白，,MGG_03356, MGG_05531, MGG_07986, MGG_ 08409和, MGG_10234,分别像MoCDIP1 到MoCDIP5

26、（稻瘟病菌的细胞死亡诱导蛋白）。我们进一步用含有5 个MoCDIP基因的双元载体进行水稻愈伤组织的农杆菌介导转化，看它是否能够获得稳定的的转基因株系并对这些基因的表达进行功能分析。大约有600个愈伤组织用于每个结构的改造。作为预期，无抗性的转基因愈伤组织在用FL-MoCDIP1, FL-MoCDIP2, FLMoCDIP3, or FL-MoCDIP4改造后逐一被获得，（数据未显示）。与此相反，约有50至80个转基因愈伤组织在用NS-MoCDIP1，NS-MoCDIP2，NS-MoCDIP3，或NS-MoCDIP4转化后被获得，在我们的实验室，具有类似于正常转化效率的效率（约8至15为其它结构

27、）。有趣的是，在第一次用FLMoCDIP5转化时产生了约40个正常效率的转基因愈伤组织，无细胞死亡的表现型。然而，当它们在选择培养基上培养2周后或更长的时间，所述转基因愈伤组织表现FL-MoCDIP5开始显示出细胞死亡的表现型（图3C）。于其他NSMoCDIP类似，在无细胞死亡中观察到转基因愈伤组织表达NS-MoCDIP5（图3C）。这些结果，与在水稻原生质体瞬时表达测定一致，证实了5个 MoCDIP诱导的细胞死亡时，全长蛋白在水稻细胞中表达。为了在功能上研究五个已鉴定的MoCDI的分泌功能，我们从先前公开的方法中选择酵母分泌测定法（Lee等l. 2006）。FL-MoCDIP和NS-MoCD

28、IP的序列都被融合到缺少其自己的信号肽序列的酵母转化酶基因（SUC2）的N-末端的框架中。该融合构建体被转化到酵母菌株DBY2445中(Lee等. 2006)，一个缺少蔗糖转化酶的突变体，并将转化的酵母直接用蔗糖培养基培养，测定了分泌。正如我们所预料的，用构建体，包括NS-MoCDIP-SUC2融合的酵母菌株在蔗糖培养基（补充图.S1）上不生长，原因是缺乏用来催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖作为碳源的转化酶的分泌。与此相反，所有五个含有FL-MoCDIP-SUC2融合的构建体使酵母突变株能够生长蔗糖培养基上，确认了5个 MoCDIP的预测的信号肽的功能在于引导转化酶融合体的分泌途径。这些结果，再加上

29、其产物表明该信号肽需要MoCDIP在水稻细胞中表达以诱导稻的细胞死亡，显示这些蛋白最有可能作用于植物质外体空间。然而，这些蛋白质在植物细胞中的确切的目标部位还有待进一步研究。图3. 鉴定五个在水稻细胞中诱导细胞死亡的植物中表达的假定分泌蛋白。A, 水稻原生质体瞬时表达分析的方法鉴定稻瘟病菌的分泌蛋白能诱导水稻细胞死亡的示意图。稻原生质进行共转染用b-葡糖醛酸酶（GUS）构建体（Promoter-GUS-Tnos）和其他携带稻瘟病菌分泌蛋白的基因的构建体（Promoter-M.o gene-Tnos）报道。水稻细胞活力检测基于监视降低的GUS表达水平。MoCDIP=稻瘟病菌细胞死亡诱导蛋白。B,

30、 五个全长的MoCDIP在水稻原生质异位表达导致细胞活力降低。CK=用GUS标记转染的原生质体样品和一个空载体对照; 1 to 5 =原生质体样品的转染用GUS标记，而另一个构建体分别携带MoCDIP1到MoCDIP5。数据条显示出的平均值来自在一个实验中的三个一式三份的样品。每个实验至少重复3次，具有相似的结果。C, 一个完整的而不是截断非信号肽的MoCDIP5的异位表达导致转基因水稻愈伤组织细胞的死亡。CK =空载体转化的水稻愈伤组织；NS-MoCDIP5 =用携带截断非信号肽构建的MoCDIP5转化的水稻愈伤组织；FL-MoCDIP5 =携带切去顶端的全长MoCDIP5转化的水稻愈伤组织

31、。照片拍摄在约20天的时候，此时新获得的转基因愈伤组织保持在选择培养基上。转化实验重复两次，观察到类似结果。D, 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对NS-MoCDIP5 或 FL-MoCDIP5在转基因水稻愈伤组织中表达的分析。CK=与空载体转化的水稻愈伤组织对照的RT-PCR结果; 1 to 3 =来自三个独立的转基因愈伤组织系的RT-PCR结果。1.4 MoCDIP基因在受感染的叶子和附着胞中表达。通过实验证实MoCDIP基因在感染的叶子上表达，并确定了它在附着胞和菌丝体上的表达模式，我们从接种分离出来的烈性敏感菌KJ201的日本晴水稻叶片中提取的RNA以及从稻瘟病菌附着胞和菌丝体中提

32、取RNA，进行了逆转录 - 聚合酶链反应（RT-PCR）。由于在早期感染阶段，真菌团在被感染的叶子中的比例很低， 72 hpi以前未检测到Mo28S转录。于Mo28S转录相似，MoCDIP2和MoCDIP4转录物在72 hpi时从被感染的水稻叶片中检测出来，在96 hpi之前从感染水稻叶子中未检测到MoCDIP1，MoCDIP3，和MoCDIP5的转录（图4）。这一结果证实了这5个MoCDIP在感染阶段表达。我们对在MoCDIP1和MoCDIP2的转录物在附着胞和菌丝体的表达情况进行检测，结果显示与之前相比拥有相对较高的表达，MoCDIP3，MoCDIP4，和MoCDIP5的转录物只在附着胞中

33、被检测到（图4）。图4. 五个稻瘟菌的细胞死亡诱导蛋白基因（MoCDIP）在植物中的表达模式。总RNA样品是从接种后0，24，48，72，96，或120小时的感染的水稻叶片中提取的，使用特异性引物从外生稻瘟病菌附着胞（A）和菌丝体（M）进行反转录 - 聚合酶链式反应。1.5 MoCDIP在非寄主植物细胞中诱导细胞死亡。许多病原菌的效应分子在非寄主植物细胞中能够诱导细胞死亡(Rep 2005)。为了确定的5个MoCDIP在非寄主植物细胞中是否影响细胞的死亡，我们在玉米（玉蜀黍），拟南芥和本塞母氏烟草这三个模式植物的原生质体中进行MoCDIP基因的瞬时表达检测。与在水稻原生质中观察到的结果一致，5

34、个FLMoCDIP但不是NS-MoCDIP在玉米原生质中的瞬时表达体引起的细胞活力显著降低（图5A）。而对于在双子叶植物拟南芥和本塞母氏烟草的原生质体中FL-MoCDIP基因的瞬时表达测定，结果显示除了FLMoCDIP2，都造成显著的细胞活性降低。与在水稻细胞中的结果相似，所有5个NS-MoCDIP基因在任一种拟南芥或本塞姆氏烟草的原生质体中的表达都没有降低细胞活力（图5B和C）。我们还通过农杆菌介导的瞬时表达的方法测试了在本塞姆氏叶片的5个MoCDIP基因。含有空质粒pGD的根瘤农杆菌和一个记为WtsE的pGD重组体分别作为阴性和阳性对照。WtsE是一种细菌性的第三类效应，在寄主和非寄主植物

35、中都能诱导细胞死亡(Ham 等. 2008)。与原生质体检测的结果相一致，农杆菌菌株渗入的本塞姆氏烟草的叶片显示FL-MoCDIP1，FLMoCDIP3，FL-MoCDIP4和 FL-MoCDIP5致使细胞死亡（图5D）。与此相反，在FL-MoCDIP2菌株的渗入区，以及携带NS-MoCDIP构建体的菌株的渗入区，并没有导致细胞死亡。我们进行了RT-PCR分析来检查的MoCDIP基因瞬时表达，结果表明， FL-MoCDIP和NS-MoCDIP这两种基因在本塞姆氏烟草叶的渗入区表达水平相似（图5E）。这些结果证实MoCDIP1，MoCDIP3，MoCDIP4，和MoCDIP5，但不是MoCDIP

36、2诱导单子叶和双子叶植物这两种物种的细胞死亡。 FL-MoCDIP菌株和WtsE菌株在诱导烟草本塞姆氏叶细胞死亡的时间和外观上强度不同。WtsE菌株引起的细胞死亡症状通常开始于农杆菌渗入后的36至48小时，且FLMoCDIP1，FL-MoCDIP3，和FL-MoCDIP4菌株诱导通常出现在农杆菌渗入的2至3天，有大量的细胞围绕渗入部位死亡。然而， FL-MoCDIP5诱导的症状一般是在农杆菌渗入后4至6天才可见，并在渗入区出现微弱的坏死斑点。该结果与FLMoCDIP5只有在相对长期培养的水稻愈伤组织上表达并观察到细胞死亡，一起表明，FL-MoCDIP5诱导延迟型的微弱的细胞死亡。图5.一个完整

37、的而不是截断非信号肽的稻瘟病菌的细胞死亡诱导蛋白MoCDIP的瞬时表达诱导非寄主植物细胞的细胞死亡。A，B，和C，5个MoCDIP分别在玉米、拟南芥和本塞姆氏烟草原生质体中的瞬时表达分析。CK =用â-葡糖醛酸酶（GUS）标记转染的原生质体样品和一个空载体对照；1 to 5 =原生质体样品的转染用GUS标记，而另一个构建体分别携带MoCDIP1到MoCDIP5。D, 通过使用农杆菌的方法检测5个MoCDIP在本塞姆氏烟草叶中的瞬时表达。农杆菌渗入法在相同叶子上一起进行，分别是用携带空载体为对照（pGD），阳性对照(WtsE)，非信号肽序列构建的MoCDIP (NS-MoCDIP)和全

38、长构建MoCDIP(FL-MoCDIP)根癌农杆菌。E，逆转录 - 聚合酶链式反应（RT-PCR）分析农杆菌渗入本塞姆氏烟草叶中MoCDIP的表达。所有的RNA都是从接种36h后的本塞姆氏烟草叶中提取。 CK = 渗入对照的空载体组织的RT-PCR的结果l；1 =渗入FL-MoCDIP组织的RT-PCR结果；2 = 渗入NS-MoCDIP组织的RT-PCR结果 。1.6 MoCDIP诱导细胞死亡的生理基础。以往的研究表明某些微生物毒素或效应诱导植物细胞死亡分享一些保守机制(Asai等. 2000; Qutob等. 2006)。为了进一步确定MoCDIP诱导细胞死亡的生理特性，我们在水稻原生质体

39、和本塞姆氏叶进行抑制实验。两种细胞死亡诱导蛋白，即WtsE和Bax，也作为对照包含在测定中。 钙信号已在细胞死亡过程中显示出重要作用(Boudsocq等. 2010; Lecourieux等. 2002)。为了确定钙信号是否是MoCDIP诱导细胞死亡所必需的，我们在抑制实验中应用了三氯化镧这种钙通道抑制剂。三氯化镧的应用阻止了所有MoCDIP的瞬时表达诱导的细胞死亡，这表明由这些蛋白质介导的细胞死亡过程是依赖于钙信号传导通路的。 光强度已被证明是诱导细胞死亡的一个重要因素，通过引发一些毒素或效应（(Asai等. 2000; Qutob等. 2006）。为了测试MoCDIP诱导细胞死亡是否与光相

40、关，我们在有光或黑暗中将MoCDIP转殖到水稻原生质体。任何一个条件培养下的原生质体样品之间的细胞活力没有差别，表明在水稻原生质体中由MoCDIP诱导的细胞死亡过程是光独立的（表1）。与此相反，在黑暗中的本塞姆氏烟草叶片中MoCDIP瞬时表达不诱导任何细胞死亡性病变（表1），这表明在在本塞姆氏烟草叶片中MoCDIP诱导的细胞死亡是光依赖的。有研究表明，一些抗凋亡蛋白如BCL-2家族蛋白和bax抑制剂-1（BI-1）可以抑制各种类型的细胞死亡，并在酵母，植物，和哺乳动物中都能发挥这种功能（Watanabe 和Lam 2009）。抗凋亡蛋白的过表达被证明可以通过多种刺激来抑制细胞死亡，揭示了不同类

41、型的细胞死亡可具有共同的下游机制(Dickman等. 2001)。我们测试了Bcl-xL，所述BCL-2家族中的一员，以确定MoCDIP诱导的细胞死亡是否可通过抗凋亡蛋白被抑制。预先浸润携带该Bcl-xL的农杆菌细胞的表达载体在浸润携带MoCDIP，WtsE，或Bax的农杆菌细胞后没有产生细胞死亡症状。与此相反，预先渗入了含有空载体的本塞姆氏烟叶在MoCDIP，WtsE，或Bax蛋白诱导的瞬时表达显示出明显的细胞死亡的症状。这个结果表明，在本塞姆氏烟草叶中MoCDIP诱导的细胞死亡能够被抗凋亡蛋白抑制（表1）。表 1稻瘟菌的细胞死亡诱导蛋白在水稻原生质体和本塞姆氏烟草叶子中的抑制测定a RP

42、=水稻原生质体, NBL = 本塞姆氏烟草叶子, DPI = diphenyleneiodonium sulfate, + = 细胞死亡,= 无细胞死亡, ND = 未确定。b LaCl3用蒸馏水溶解，与同体积的水用于水稻原生质体或本塞姆氏烟草叶片的对照。c A一个空载体 PGD作为对照。观察到对照对细胞死亡测定没有影响。1.7 MoCDIP的序列和结构分析。 序列分析表明，5个已识别的MoCDIP在它们的序列高度多样化，与已知的在不同病原体上的细胞死亡诱导效应蛋白如Nep1-like proteins (Qutob等2006), INF1 (Kamoun等. 1997), ToxA (Ciu

43、ffetti等. 1997), ToxB (Martinez等. 2001), or Nip (Mattinen等. 2004).没有序列同源性。针对稻瘟病菌数据库和NCBI非冗余数据库后发现，在其他生物体的稻瘟病菌的基因组测序中，MoCDIP2和MoCDIP4具有相对大的同源物数目（补充图S2）。与此相反，MoCDIP1和MoCDIP5仅在其他微生物的蛋白质中有同源性（补充图S2），MoCDIP3在稻瘟病菌基因组或在其它生物体的基因组测序中都没有同源物。同源性搜索也透露MoCDIP2属于某个包含CFEM蛋白序列的家族，这个蛋白可充当一个细胞表面受体，信号转导子，或在宿主真菌相互作用中作为粘附

44、分子(Kulkarni等. 2003)；MoCDIP4是一种高度保守糖苷水解酶家族61蛋白质的同系物(Davies 和 Henrissat 1995)；虽然MoCDIP1和MoCDIP5两种蛋白质之间没有序列相似性，但都与蓖麻毒素B凝集素蛋白有相似之处。为了进一步描述参与细胞死亡诱导的MoCDIP的性质，我们搜查了蛋白质保守结构域并基于域的预测进行了缺失突变体的功能分析。构建MoCDIP的缺失突变体，除了MoCDIP3，因为它不包含任何预测域，分别在水稻原生质体和本塞姆氏烟草叶中（图6）进行测试。瞬时表达实验表明，N-末端区域的突变体MoCDIP1，氨基酸（aa）1185，足以用于诱导植物细胞

45、的细胞死亡。然而，N末端区域，氨基酸1至162，它缺乏PbH1基序中的氨基酸1至185的片段，失去诱导细胞死亡的能力，这表明PbH1基序可能在诱导植物细胞死亡中发挥重要的作用。在N-末端，MoCDIP2的CFEM结构域是诱导水稻的细胞死亡的有效区域，这表明在细胞死亡的诱导中预测GPI锚定蛋白不是必需的。至于MoCDIP4，缺乏纤维素结合结构域（CBD）的缺失突变体，被发现只能诱导微弱的细胞死亡，而且缺乏接头片段与CBD域的突变体不能诱导细胞死亡，这表明C-末端连接体片段和CBD域的是在诱导植物细胞死亡中具有重要的功能。该试验也表明，缺乏C末端或缺少潜在锌结合位点基序的MoCDIP5突变体不能诱

46、导水稻原生质体和烟草本塞姆氏烟叶的细胞死亡，这表明要于植物中诱导细胞死亡MoCDIP5的全部长度都是必须的。图6. 稻瘟病菌的细胞死亡诱导蛋白（MoCDIP）的结构分析。MoCDIP及其缺失突变体的示意图在左侧显示。MoCDIP的预测结构域或基序用有颜色的矩形表示。被删除的区域用虚线表示。MoCDIP及其缺失突变体在本塞姆氏烟草叶子或稻原生质体中瞬时表达。烟草本塞姆氏叶的农杆菌渗入试验的结果或转染的水稻原生质显示在右侧。标志+，+ - 和 -分别表示明显的细胞死亡，弱的细胞死亡和无细胞死亡。原生质体结果的数据条显示出的平均值来自在一个实验中的三个一式三份的样品。每个实验至少重复3次，具有相似的

47、结果。2 讨论2.1 水稻与稻瘟菌的相互作用的转录组分析。使用不同的基因预测算法，约12的注释基因（1,546）被预测为在稻瘟病菌基因组中鉴定的效应蛋白(Soanes等l. 2008)。这些预测的基因在感染的水稻植物的表达在很大程度上是未知的。通过采用表达序列标签（EST）分析，RL-SAGE和SuperSAGE分析被感染的稻叶在早期感染阶段，防御转录组对稻瘟病菌感染的特征(Ebbole 等. 2004; Gowda 等. 2007; Kim 等. 2001; Matsumura 等. 2003; Rauyaree 等. 2001)。然而，这些研究只确定了少数的真菌基因，主要是因为在被感染的组

48、织中真菌的RNA的比例相对较低，测序覆盖率是不够深。最近，用于从受感染的植物组织中富集真菌RNA的改进的方法已经被用来分析稻瘟病菌和稻的相互作用转录组。Kim和 associates（2010）应用EST加上消减杂交技术分析从病叶感染晚期得到的cDNA库。一共有712 个uniEST从菌体中被鉴定，占总uniEST的31。Mosquera和同事（2009）开发了一种程序，以产生严重感染的水稻叶鞘，这个程序允许总RNA即具有高比例的RNA（高达20）的分离，这种RNA源自稻瘟病菌的活体营养侵入性的菌丝。通过采用基因芯片分析，作者确定了262个真菌基因和210个水稻基因，在活体营养入侵期间诱导可达

49、10倍。在这项研究中，我们采用三个高通量技术，即RL-SAGE，MPSS和SBS，来分析稻瘟病菌感染的水稻组织的转录组。而RL-SAGE技术仅用于研究感染了亲和的分离菌的稻叶组织在96hpi的基因表达图谱， MPSS和SBS被用于研究接种任一亲和或不亲和的分离菌在接种后不同的时间点水稻叶片组织的基因表达谱。接种两种不亲和的和亲和的菌株的水稻叶片在72 hpi，只有非常有限数量的真菌基因被鉴定，因为稻叶上没有明显症状或仅有极少数褐色病变出现。在接种亲和的分离菌的96 hpi，水稻叶片出现典型的易感病斑。同样，从严重感染的叶子中检测到相当多的真菌转录产物。我们从分别RL-SAGE-96h，MPSS

50、-96h，SBS-96h的库中确定了3091（17），2327（12.3）和5099（11.4）个显著的稻瘟病菌的标记。结合三种技术的结果，我们总共鉴定了6413个稻瘟病菌的基因，其中包括被预测为编码推定分泌蛋白和可能在植物中表达的851个基因。我们的结果连同那些以前报道会为进一步研究水稻和稻瘟菌相互作用的分子机制提供有价值的信息。3个96h库的聚类分析表明，从RL-SAGE，MPSS和SBS回收的转录物部分重叠，与以前使用MPSS，RL-SAGE和寡核苷酸比较式基因体晶片（oligo array）方法的稻瘟菌转录谱的结果类似（Gowda等，2006）。该结果还表明，使用多个不同的方法可以提供

51、更全面的基因表达谱。当考虑到个人的技术，SBS似乎是转录分析最有效的方法。RL-SAGE-96h库和MPSS-96h中类似的数目稻瘟菌基因被确定（3008个和2401个特有的稻瘟菌基因从分别两个库中被鉴定），共有4730个稻瘟病菌基因从SBS-96-h库中被鉴定（图1B），几乎是其它两种方法鉴定的基因数的两倍。此外，从SBS-96h回收的稻瘟病菌的转录物包含上的大多数来自RL-SAGE-96h和MPSS-96h的稻瘟病菌转录产物。我们的研究结果表明，由于转录的深覆盖这两种水稻和稻瘟病菌的许多弱表达转录物从库中被回收。随着测序成本的迅速下降，基于SBS的超快速测序法或其他新一代测序平台将允许进行

52、更深入植物病原体相互作用转录组的表征。 2.2 利用水稻原生质体瞬时表达系统对稻瘟菌的效应物进行功能鉴定。 在受感染的水稻植物中进行的稻瘟病菌效应基因的转录分析为在植物（在水稻中表达的基因）稻瘟病菌相互作用的功能分析提供了起点。在过去的二十年中，通过定位克隆(Kang等. 1995; Orbach等. 2000; Sweigard 等. 1995)，基因关联分析(Yoshida 等. 2009)，或功能缺失(Ahn 等. 2004; Jeong 等. 2007; Kim 等. 2005; Talbot 等. 1993)的方法分离得到了一些稻瘟菌无毒或致病性效应的基因。前两个过程是费时，繁琐，而

53、且价格昂贵的。至于功能丧失的方法，它往往由于许多基因可能具有重叠的功能而受到阻碍。；例如很多敲除突变的分泌蛋白基因有没有可识别的表型（Mosquera等，2009）。因此，经济有效的，高效率的功能获得方法将是鉴定稻瘟病菌效应物的一个有价值的替代方法。至于功能获得的鉴定，农杆菌渗入瞬时检测是一种广泛使用的方法，用于许多茄科植物的植物病原菌效应物的功能表征，特别是本塞姆氏烟草和普通烟草(Munkvold 和 Martin 2009)。但是，此农杆菌渗入方法是不适用于单子叶植物。我们曾经报道的原生质体的瞬时表达系统能够直接在水稻细胞中完成检测(Chen 等. 2009a)。近日，Yoshida和同事

54、（2009年）以及Okuyama和同事（2011）检测到在水稻原生质体同时表达抗病基因和其在稻瘟菌中的同源无毒基因的过敏反应。利用该系统，他们成功地筛选出稻瘟Avr-Pia,Avr-Pii,Avr-Pik/km/kp和稻瘟病抗性基因Pia。在这项研究中，我们确定了五个稻瘟菌效应物能够在水稻细胞中诱导细胞死亡。结果表明，稻原生质体表达分析是大规模筛选鉴定诱导细胞死亡的效应物或过敏反应的高效方法。2.3 在稻瘟病菌和水稻之间的相互作用中MoCDIP的作用。 不同于许多细菌病原体，其经由III型分泌系统在宿主细胞内传送效应蛋白，真核植物病原体似乎通过真核（II型）分泌途径（Panstruga和200

55、9多兹），以分泌大量的细胞外蛋白(Panstruga and Dodds 2009)。一些分泌蛋白被转运到宿主细胞并且在宿主细胞质中起抑制宿主防御功能。在寄主的质外体空间还有许多其他功能来方便病原体的寄生生活。后者包括降解酶，毒素，或植物酶的抑制剂。最近，建议给予效应物一词的一个更广泛的定义。由于分泌蛋白施加给植物细胞的一些效果，定义中应包含这些分泌蛋白（Hogenhout等，2009）。在过去的几十年中，已经从真核植物病原中确定一些质外体效应物与毒素或激发子活性可以在植物中诱导细胞死亡(Rep 2005)。许多质外体效应物在半活体营养或死体营养植物病原体的毒力中发挥积极作用(Ottmann

56、等. 2009; Qutob 等. 2006)。从42个在植物中表达的稻瘟病菌鉴定的分泌蛋白中，我们成功地确定了五个新的效应物MoCDIP1到MoCDIP5诱导植物细胞死亡。鉴于这些基因在感染阶段表达，特别是96 hpi（图4），我们推测，其中一些诱导细胞死亡的效应物可在重度感染的死体营养阶段后期有利于稻瘟病菌的定殖，这是不同病理系统之间的共同机制(Gijzen 和 Nurnberger 2006)。确定这些效应物在水稻细胞的受体并定义引起水稻细胞坏死的相互作用将会是十分有趣的。5个MoCDIP在它们的序列中高度多样化。MoCDIP3不与任何已知蛋白有任何显著相似度，MoCDIP1，MoCDI

57、P2，MoCDIP4和MoCDIP5都与稻瘟病菌或其他微生物有密切相关的同系物。我们的分析还表明，诱导细胞死亡的五个不同MoCDIP有相似生理的表现型，如对光反应，钙离子通道的抑制剂和以的Bcl-X1介导的细胞死亡抑制。这些结果一起表明，5 个MoCDIP的细胞死亡诱导机制可能是类似的，但它们的序列是十分不同的。在五个MoCDIP中，MoCDIP4属于一个各种各样的微生物的纤维素分解酶的大家族。相关的同源蛋白包括内切葡聚糖酶，木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶。一些以前的研究已经发现这一酶家族的基因编码成员表达通过丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径来调节，在调节发病机理，以及其他功能中发挥关键作用s (Le

58、v and Horwitz 2003; Madhani 等. 1999; Roberts 等. 2000)。然而因为纤维素酶之间的冗余，敲除一个甚至几个基因的基因编码纤维素分解酶有很少或没有后果的毒力(Lev and Horwitz 2003)。在这份报告中，我们证明MoCDIP4，一个公认的内切葡聚糖酶，当它在植物细胞中表达时诱导细胞死亡。因此，我们的发现为通过该纤维素分解酶可以帮助入侵微生物的机制提供了新的线索。MoCDIP4包含两个保守结构域，糖基水解酶家族61域和真菌的核心区域。最近，真菌核心区域已被证明是能诱导植物细胞死亡的疫霉属诱导凝集素CBEL(Gaulin 等. 2006)和木

59、霉膨胀素的植物根系定殖起着重要作用的一种结构(Brotman 等. 2008)。更有趣的是，这个区域在微生物被确定为新型的PAMP（Brotman 等. 2008; Gaulin 等. 2006）。与以前的报道一致，我们发现MoCDIP4的核心区域在诱导植物细胞死亡的过程中起着重要作用（图6），增强了核心区域发挥功能上保守的作用的观念，如在不同的植物病理体系中充当一个PAMP激发子。3 材料和方法3.1 植物材料和真菌菌株。在本研究中所用水稻（Oryza sativa）材料为野生型日本晴水稻和携带抗稻瘟病基因Pi9的转基因日本晴水稻（Qu 等. 2006）。在这项研究中使用的稻瘟病菌菌株包括Che86061和KJ201。3.2 RL-SAGE，MPS