实验二__中和试验

1、实验三实验三 血清中和试验血清中和试验（固定病毒（固定病毒稀释血清法）稀释血清法）一、实验目的一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒的测定方法，掌握固定病毒稀释血清法稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。的操作步骤和计算方法及含义。二、原理二、原理 病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形 态 学 变 化 ， 出 现 细 胞 病 变 效 应形 态 学 变 化 ， 出 现 细 胞 病 变 效 应（CPE）。特异性中和抗体与病毒结合）。特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制细后，可使病毒颗粒失去

2、感染性，抑制细胞病变的出现。胞病变的出现。三、血清中和试验的分类三、血清中和试验的分类1 1、终点法、终点法2 2、蚀斑减数法、蚀斑减数法3 3、交叉保护试验、交叉保护试验固定病毒固定病毒稀释血清法稀释血清法固定血清固定血清稀释病毒法稀释病毒法四、用途四、用途1 1、疾病诊断、疾病诊断2 2、病毒分离株的鉴定、病毒分离株的鉴定3 3、不同病毒株的抗原关系研究、不同病毒株的抗原关系研究4 4、疫苗免疫原性的评价、疫苗免疫原性的评价5 5、免疫血清的质量评价、免疫血清的质量评价6 6、测定实验动物血清中是否存在抗体、测定实验动物血清中是否存在抗体六、固定病毒六、固定病毒稀释血清法的操作步骤稀释血清

3、法的操作步骤测定病毒液的测定病毒液的TCIDTCID5050( 10-4.5/0.1ml )将测好将测好TCIDTCID5050的病毒液稀释成的病毒液稀释成200200个个TCIDTCID5050的病毒的病毒悬液。悬液。将血清作连续倍比稀释（具体方法是在将血清作连续倍比稀释（具体方法是在8 8个个EPEP管管中各加入中各加入500500lD-HankslD-Hanks，第一管再加，第一管再加500500l l待检待检血清，混匀后，吸血清，混匀后，吸500500l l至下一管，如此下去。至下一管，如此下去。一直到一直到1:2561:256，共，共8 8个稀释度），再将个稀释度），再将8 8个个E

4、PEP管内管内各加等量各加等量( (500l) )病毒液，混匀。病毒液，混匀。 同时设同时设阳性血清对照，阳性血清对照，待检血清毒性对照，病毒待检血清毒性对照，病毒对照和正常细胞对照，其中：对照和正常细胞对照，其中： 1 1 阳性血清对照：将阳性血清做阳性血清对照：将阳性血清做8个个2倍比稀释度，倍比稀释度，每孔各加每孔各加50l病毒液和病毒液和50l各稀释度血清。各稀释度血清。 2 待检血清毒性对照待检血清毒性对照:将待检血清做将待检血清做8个个2倍比稀释倍比稀释度，每孔各加度，每孔各加50lD-Hanks和和50l各稀释度血清各稀释度血清.3 病毒对照病毒对照: :做做4 4个个1010倍

5、比稀释度倍比稀释度( (200个个TCID50、20个个TCID50、2个个TCID50、0.2个个TCID50 ),每孔每孔各各加加50lD-Hanks和和50l各稀释度病毒液各稀释度病毒液。 4 4 正常细胞对照：每孔各加正常细胞对照：每孔各加100100lD-Hanks.将血清病毒混合液（包括阳性血清对照组）将血清病毒混合液（包括阳性血清对照组）放入放入37 5%CO2培养箱中作用培养箱中作用45min-60min.感作完成后感作完成后每个稀释度分加至每个稀释度分加至96孔细胞板中，孔细胞板中，每孔每孔100l，继续置，继续置37 5%CO37 5%CO2 2培养箱培养培养箱培养1.5h

6、1.5h，洗液洗液（D-HanksD-Hanks）洗一遍，换维持液，）洗一遍，换维持液，放温箱中培养，放温箱中培养，逐日观察并记录结果逐日观察并记录结果。 结果计算，按结果计算，按Reed-MuenchReed-Muench两氏法或两氏法或KarberKarber法进行。法进行。1212141418181161161321321641641128112812561256血清血清实验孔实验孔阳性血清对照阳性血清对照细胞细胞对照对照病毒病毒对照对照待检血待检血清毒性清毒性对照对照血清稀血清稀 CPE 无无CPE 累计累计 保护率保护率%释度释度 孔数孔数 孔数孔数 CPE孔数孔数 无无CPE孔数孔

7、数 1:2（10-0.3） 0 8 0 30 100(30/30)1:4（10-0.6） 0 8 0 22 100(22/22) 1:8（10-0.9） 2 6 2 14 87.5(14/16)1:16（10-1.2） 2 6 4 8 66.7(8/12)1:32（10-1.5） 6 2 10 2 16.7(2/12)1:64（10-1.8） 8 0 18 0 0(0/18)1:128（10-2.1） 8 0 26 0 0(0/26)lgPDlgPD5050= =高于高于50%50%的保护率血清稀释度的对数的保护率血清稀释度的对数+ +距离距离比例稀释度对数的差比例稀释度对数的差=-1.2+0.33=-1.2+0.33(-0.3)(-0.3)=-1.299 =-1.299 距离比例距离比例= =（高于（高于50%50%的保护率的保护率-50% -50% ）/ / （高于（高于50%50%的保护率的保护率低于低于50%50%的保护率）的保护率） = =（66.7-5066.7-50）/ /（66.7-16.766.7-16.7） = 0.33 =