现代色谱PPT课件

1、1 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1 1经典LCLC：仅做为一种分离手段 柱内径1-3cm1-3cm，固定相粒径100m 100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（HH，nn） 分析周期长 无法在线检测2 2HPLCHPLC：分离和分析 柱内径2-6mm2-6mm，固定相粒径10m10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（HH，nn） 分析时间大大缩短 可以在线检测第1页/共59页23、HPLC法与经典LC性能对比 P170 表4-1相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸

2、点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%第2页/共59页3续前2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3操作条件差别

3、GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第3页/共59页4三、HPLC的特点(P170) “三高” “一快” “一广” 第4页/共59页5A滞留在流动相中的时间分数，即为保留比()()25.02.01.015.02.0R BR Att015.02.06.52.0Rtkt110.13311 6.5Rk 第5页/共59页6 HPLCHPLC优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。( (适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。) ) 缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。

4、目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。第6页/共59页7第7页/共59页8四、HPLC的分类 P171-2思考题 从分离效率、分离速度、灵敏度、样品容量、操作技术等方面，列表比较经典液体柱色谱、气相色谱、高效液相色谱的异同点。第8页/共59页第二节 基本原理一、色谱流出曲线和色谱峰1、色谱流出曲线 样品经色谱柱分离后的流出物通过检测器时所产生的电信号随时间变化的曲线色谱流出曲线（色谱图）2 、基线（1）噪音（2）漂移依据流出曲线图：依据流出曲线图： 可以判断混合物的分离的好坏可以判断混合物的分离的好坏 对混合物中每一组分进行定性、定量对混合物中每一组分进行定性、定量在操作条件下，仅

5、有纯流动相进入检测器时的流出曲线。第9页/共59页10 1、色谱图、色谱图可见：可以根据色谱峰（色谱流出曲线）做以下工作：可见：可以根据色谱峰（色谱流出曲线）做以下工作： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数； 根据色谱峰的保留值（峰位），可以进行定性分析；根据色谱峰的保留值（峰位），可以进行定性分析； 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； 色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择

6、是否合适的依据。色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。 3、色谱峰、色谱峰色谱峰色谱峰 (正常峰正常峰、前延峰、拖尾峰、前延峰、拖尾峰)：第10页/共59页11 不对称因子“fs”：用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。hAB0.05hAABfs2对称因子fs 0.95-1.05 1.05 峰拖尾的原因是硅胶基质上的SiOH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。 改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。第11页/共59页12内镶嵌极性基团亲水, 形成水屏蔽

7、层。 优点：屏蔽了硅羟基的吸附作用；亲水 内嵌极性基团反相固定相与传统反相固定相的区别内嵌极性基团反相固定相传统反相固定相第12页/共59页13 二、定性参数二、定性参数 1. 保留时间 保留时间“ tR”：进样至出峰的时间。 死时间“ t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。 死时间“ t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳， 反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。 保留体积：VRtRFC ( FC - 流动相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR tRt0 调整保留体积：VR VRV

8、0tR FC第13页/共59页14进样W1/20.5h0.607ht信号 h 26W标准差6 6半峰宽W Wh/2h/2峰宽WW W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上所截得的距离。三、柱效参数1、区域宽度Wh/2=2.355 标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.6070.607处峰宽的一半。W = 4 =1.699W h/2第14页/共59页15 ： 2.塔板数与塔板高度（评价柱效指标） 定义：理论塔板数： 1/2h2W1/2 为便于测量，改用半峰宽：1/2hW1/2(或Fct1/2)W 最常用的计算式：另一计算式：(W不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。)2RtN22/154.5Wt

9、NR216WtNR第15页/共59页16 理论塔板高度：(L柱长) 经验式：H2dP(dP10H20N5万)(dP5H10N10万)dP柱填料的颗粒直径 柱效的测定和计算：以反相柱为例，流动相用87(V/V)的甲醇:水，样品用苯、联苯、萘等，加快记录仪的走纸速度，测出半峰宽W1/2，并由走纸速度换算为与tR相同的单位“分”或“秒”，代入公式，计算出柱效N。 NLH第16页/共59页衡量柱效能的指标 n = L / Hn = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为 2221)(16)(54. 5WtWtnRR2,221)(16)(54. 5WtWttnRMR有效提高柱效的方法：（J） 固定

10、相填料要均一，颗粒细，装填均匀。 流动相粘度低。 低流速。 升高柱温。第17页/共59页18四、相平衡参数1. 分配系数（distribution coefficient）分配系数: 在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相间达到分配平衡时的浓度比值。 msccK cs、cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； 分配色谱： 分配系数 吸附色谱： 吸附系数 离子交换色谱： 选择性系数 凝胶色谱（体积排阻色谱）：渗透系数第18页/共59页19容量因子：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的质量比，称为容量因子，也称分配比，用k表示。 2. 容量因子 （capacity fact

11、or）msmmssWWVcVckcs、cm分别为组分在固定相和流动相的浓度(g/ml)；Vm为色谱柱中流动相的体积，近似等于死体积， Vs为色谱柱中固定相的体积。第19页/共59页20容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。msVVKk 第20页/共59页213分配系数和容量因子的关系4. 分配系数和容量因子与保留时间的关系 设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比：vRusmVkKVl在定距展开如柱色谱中RLtoLtl因此0

12、RtRtmmmmmsmSmmsstNC VRttNNC VCV1111smRVkKV第21页/共59页22(1)RLLtku000(1)tktt k000RRtttktt0(1)sRmVttKV或0(1)sRmVVVKV5.分配系数与保留体积的关系 k与保留参数间的关系理论上可以推导出：MRMRVVttk第22页/共59页23SRKVkVV00VKVVSR色谱过程基本方程：ktVVKttsR000)1 ()1 (000ktVVKttsR3 选择性因子（相对保留值relative retention） 在相同的操作条件下，相邻两组分配系数之比或容量因子之比，用r2,1 表示 12121 , 2k

13、kKK)1()2()1()2(1 , 2RRRRVVtt小结： （1）色谱条件一定时，K或k值越大，则组分的保留值也越大。（2） 两个组分的K或k值相等，则两个组分的色谱峰必将重合。（3）两个组分的K或k值差别越大，则相应的两色谱峰相距就越远。第23页/共59页24分离度: 相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比，用R表示。21)1()2(21)1()2()(22wwttwwttRRRRRtR(1) 、 tR(2) 分别为组分1和组分2的保留时间，w1、w2分别为相应组分色谱峰的峰底宽度，与保留值的单位相同。第24页/共59页25设两相邻峰的峰宽相等，即w1=w2，则2)1()2

14、(21)1()2()(2wttwwttRRRRR2)(16WtnR又知ntntWRR)2(2)2(2416)1)(1)(4(221 , 21 , 2kkrrnR1 , 212)1()2(rKKttRR2)2(kttMR4n称为柱效项；)1(1 , 21 , 2rr称为柱选择项；)1(22kk第25页/共59页第26页/共59页如何根据具体情况改进分离度？第27页/共59页28例 1 1在一根10cm10cm长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.68,0.68,要使它们完全分离以(R=1.5),(R=1.5),则柱长应为多少？ 即在其他操作条件不变的条件下，色谱柱长要选择50cm左右才能使分离度达

15、R=1.5,组分达到完全分离。2121221)(LLnnRRcmcmRRLL507 .48)68.05 .1(10)(221212第28页/共59页29 例2 2 已知某色谱柱的理论塔板数为3600,3600,组分A A和B B在该柱上的保留时间为27mm27mm和30mm,30mm,求两峰的半峰宽和分离度. . 解: w1/2=w/1.7 ntwR4w1=427/(3600)1/2=1.8 mm (w1)1/21.8/1.71.06 mmw2=430/(3600)1/2=2.0 mm (w2)1/22.0/1.71.18 mmR2(30-27)/(1.8+2)6/3.81.6第29页/共59

16、页30 例3 3 已知物质A A和B B在一个30.0cm30.0cm柱上的保留时间分别为16.4016.40和17.6317.63分钟. .不被保留组分通过该柱的时间为1.301.30分钟. .峰宽为1.111.11和1.21mm,1.21mm,纸速为1mm/min,1mm/min,计算: : (1)(1) 柱分辨本领; ;(2)(2) 柱的平均塔板数目; ;(3)(3) 塔板高度; ;(4)(4) 达到1.51.5分离度所需的柱长度; ;(5) (5) 达到1.51.5分离度（在较长柱上） ，物质B B洗脱 大约需要的时间. .第30页/共59页31 解: (1) R=2(17.63-16

17、.40)/(1.11+1.21)=1.06 (2) nA=16 (16.40/1.11)2=3493 nB=16(17.63/1.21)2=3397 nav=(3493+3397)/2=3445=3.44103 (3) H=L/n=30.0/3445=8.70810-3cm =8.7110-3cm (4) n2=34452.25/1.124=6.90103 源于n1/n2=（R1/R2)2 L=nH=6.901038.7110-3=60.1cm (5) tR2=tR1(R2/R1) =17.631.5/1.06 =24.95（分钟）第31页/共59页32例4 组分A在柱内的移动速度只有流动相速

18、度的1/10，柱内液体流动相体积为2.0ml，固定相体积为0.5ml。求流动相流量为10ml/min时，组分A停留在固定相中的时间和它的分配系数。R=1/1+k = 0.1 k = 9VR=Vm(1+k)=2.0（1+9）=20mltR=VR/F0=20/10=2.0mint0=tR/(1+k)=2.0/(1+9)=0.2min组分停留在固定相中的时间为：02.00.21.8minRRttt 1.8 1018RRcVtFmlRsVKV 18360.5RsVKV第32页/共59页33例5 组分A和B分别在15.0min和25.0min洗脱出柱，而非滞留组分只需2.0min。 求：1）B对A的相对

19、保留时间 2）A的容量因子 3）A滞留在流动相中的时间 分数()()25.02.01.7715.02.0R BR Att015.02.06.52.0RtktA滞留在流动相中的时间分数，即为保留比110.13311 6.5Rk 第33页/共59页34六、色谱分离的前提0()sRRARBABmVttttKKV(1)sRAoAmVttKV0(1)sRBBmVttKV0()RABtt kk第34页/共59页35第二节 塔板理论 塔板理论假定： 在色谱柱内一小段长度H内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。H称为理论塔板高度 。 流动相进入色谱柱不是连续的，而是间歇式的，每次进入一个塔板体积。 试样和新鲜

20、流动相都加在第0号塔板上，且试样的纵向扩散可以忽略。 分配系数在各塔板上是常数。第35页/共59页36一、二项式分布 假设：分离含有2个组分的混合物 K= Cs / Cm = 2 Vs = Vm 试样溶液100%加到零号塔板上 上层（流动相溶质含量）：mm 下层（固定相溶质含量）：ms mm + ms = 1 经过N次转移后，在各塔板内组分的质量分布符合二项式的展开式： （mm + ms)N = 1N=3，K=2时，mm=0.333，ms=0.667， 各塔板内溶质的含量为： （0.667+0.333)3 = 0.297 + 0.444 + 0.222 + 0.037 （0号）（1号）（2号）

21、 （3号）第36页/共59页37第37页/共59页38转移N次后第r号塔板中的质量Nmr 例如，N=3，r=3时，即转移3次后，在第3号塔板内的溶质分数为：sm!()!NNrrrNmmmr Nr3(3 3)333!0.6670.3330.0373!(33)!m第38页/共59页39二项式展开式各项相当于各塔板中某一个组分溶质的总量11NrsmmC CNmmrmmmm 总NmmrmmssC VmC VCV11NrmK第39页/共59页40Nssrmmmm 总NssrmmssCVmC VCV1NrKmK当 n=3, r=0时, 求流动相和固定相中溶质的含量10.2970.09912sm 20.29

22、70.1982 1sm 第40页/共59页41二、正态分布J J -标准差 tR-保留时间C0为峰面积A，即相当于某组分的总量 C -任意时间t时的浓度 2R2( -)02=e(1)2t tCC第41页/共59页42 (1) t = tR时，有极大值 , Cmax即流出曲线的峰高，也可用h表示。 将h及W1/2=2.355代入上式 ，得峰面积C0或A： A=1.065W1/2h 将式 (2) 代入式 (1) 得： 不论 t tR或 t tR时，浓度C恒小于Cmax。 C随时间t向峰两侧对称下降。0max(2)2CC2R2( -)2max=et tC C第42页/共59页43三、理论塔板高度和理

23、论塔板数2()Rtn21 25.54()RtnW216()RtnW第43页/共59页44 H =L/n 如果用 代替tR，为有效塔板数：Rt2()effRnt21 25.54()effRntW216()effRntW理论塔板高度为：第44页/共59页45 例1 在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.50min，半峰宽为0.10cm。求理论塔板高度和每米的理论塔板数。231.505.54()2.4 100.10/2.0n 320000.83 (mm)2.4 10H 每米理论塔板数为：2.4103/2=1.2103(m1)第45页/共

24、59页46第三节 速率理论 一、气相色谱速率理论方程式 Van Deemter 方程式： H =A + B/u + Cu H -塔板高度 A -涡流扩散系数 B -纵向扩散系数 C -传质阻抗系数 u -流动相的线速度(cm/s) 第46页/共59页47第47页/共59页48 塔板高度由A、B/u和Cu三项构成。 H =A + B/u + Cu 在低线速（0u最佳之间）时， u越小，B/u项越大，Cu项越小。此时，Cu项可以忽略，B/u项起主导作用，u增加，H降低，柱效高。 在高线速时（uu最佳），u越大，Cu项越大，B/u项越小，Cu项起主导作用。u增加，H增加，柱效降低。 （一）影响板高因

25、素的讨论 1涡流扩散(eddy diffusion)也称为多径扩散。 A=2dp-填充不规则因子 dp-填料 (固定相) 颗粒的平均直径 第48页/共59页492纵向扩散(longitudinal diffusion) B = 2 Dm -弯曲因子Dm -组分在流动相中的扩散系数 Dm与温度成正比，与相对分子质量的平方根成反比；纵向扩散与流动相的线速率成反比，所以使用较高流速、降低柱温和采用相对分子质量较大的载气，都能减小分子扩散。 载气线速度小时，用N2 载气线速度大时，用H2第49页/共59页503传质阻抗 (mass transfer resistance) C = Cm + Cs2mm

26、pm()CCdD2223(1)fssdkCkDCs -固定相传质阻抗系数k -容量因子df-固定液的液膜厚度Ds-溶质在固定相中的扩散系 数第50页/共59页51减少Cs的方法： （1）降低固定液液膜厚度 （2）增大Ds：柱温升高，Ds增大 （3）k值对Ds 的影响：2(1)kk 当k1时，k增大，Cs减小当k 时，Cs0当k=1时，最大，柱效最低。此时，216fssdCD1kkCs当时， 减小，减小1k一般情况下，第51页/共59页52（二）Van Deemeter方程式在GC中的表现形式 1. 填充柱 （1）一般情况下，Cm可以忽略，CCs H = A + B/u + Csu 将A、B、C

27、s代入上式中，则： 222223(1)fpmmdkHdDuukDuDdkkuDdkkuDdHsfmpmp22222)1 (32)1 (01. 0222.开口毛细管柱0Van DeemertmsAHB uC uC u因为于是，方程式可简化为：第52页/共59页53二、液相色谱法速率理论 （一）Giddings液相色谱速率方程式 Giddings与Snyder等人提出的液相色谱速率方程式： H = He+ Hd+Hm+Hsm+Hs 或： H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu2mBD因为mDT而5mmDD10B/u又因为液相色谱的比气相色谱的约小倍，所以，纵向扩散项可以忽略不计。于是：msmsHA C uC uC umsmseHHHHH或第53页/共59页54222222(1)230(1)(1)(1)ppfpmmsdddkkHdWuu quDkDkD 2222ppfpmsmsmmsdddHdCuCuCuDDD简