生技实验指导

1、实验一 培养基母液的配制一、实验目的与意义学习大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类母液的配制方法。在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。二、实验用具和药品电子天平（感量为1/1000g、1/10000g）、烧杯（500mL、100mL）、容量瓶（100mL、500mL、1000mL）、药匙、称量纸、小玻璃棒、电磁炉。配制各种母液所需药品、1MHCl、95%乙醇。三、实验步骤（一）大量元素母液的配制（10×） 按照培养基配方的用量，把各

2、种化合物的用量扩大10倍，用1/1000g感量的天平分别称取，用蒸馏水将CaCl2除外的其它化合物溶解后倒入1000mL容量瓶中，最后向容量瓶中缓缓加入溶解的CaCl2，以免形成沉淀。用蒸馏水定容到1000mL。表1 MS培养基大量元素母液制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大10倍用量(mg) 1NH4NO3165016500 定容至1000ml2KNO31900190003KH2PO417017004MgSO4·7H2O37037005CaCl2·2H2O 4404400（二）微量元素母液的配制（100×） 配成两种母液：母

3、液、母液。母液的配制：用1/10000g的电子天平分别称取CuSO4·5H2O和 CoCl2·6H2O各50mg，用蒸馏水溶解后倒入100mL容量瓶中定容。母液（微量元素母液）的配制：将其余微量元素化合物按照培养基配方用量的100倍，用1/10000g的电子天平分别称取，用蒸馏水溶解，待全部溶解后倒入容量瓶中，用移液管吸取5mL母液加入容量瓶中，最后用蒸馏水定容到1000mL。表2 MS培养基微量元素母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大2000倍用量(mg)1CuSO4·5H2O 0.02550定容至100mL2CoCl2

4、3;6H2O  0.02550表3 MS培养基微量元素母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍用量(mg)1KI0.8383定容至1000mL2Na2MoO4·2H2O0.25253MnSO4·4H2O22.322304ZnSO4·7H2O8.68605H3BO36.26206CuSO4·5H2O 母液取5mL7CoCl2·6H2O  （三）铁盐母液的配制（100×） 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。配制方法是：按培养基配方用量的1

5、00倍，用1/100g的天平称取FeSO4.7H2O和Na2-EDTA，分别用蒸馏水溶解，在沸水浴中将两种溶液混合，冷却后定容到1000mL。表4 MS培养基铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍用量(mg)1Na2-EDTA  37.33730定容至1000mL2FeSO4·7H2O 27.852785（四）有机物母液的配制（100×） 按照培养基配方用量的100倍，用1/10000g的电子天平分别称取。用蒸馏水溶解，待全部溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水定容到1000mL。表5 MS培养基有机物母液的制备序号化合物名称培养基浓度（

6、mg/L）扩大100倍用量(mg)1甘氨酸2200定容至1000mL2盐酸硫胺素(VB1)0.4403盐酸吡哆素(VB6)0.5504烟酸0.5505肌醇10010000（五）激素母液的配制（1mg/10mL） 激素在培养基中的用量较少，为了使用方便和准确，也应配成母液备用。激素一般不易溶于水，所以要借助助溶剂，不同激素用的助溶剂不同：1. 配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。2. 细胞分裂素，例如KT，6-BA应先用少量1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。3. 配制生物素，用稀

7、氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。四、作业1第一组同学配制大量元素（10×）和6-BA母液；第二组同学配制微量元素（100×）和2,4-D母液；第三组同学配制有机物（100×）和NAA母液；第四组同学配制铁盐（100×）和KT母液。2完成实验报告。 表6 MS培养基配方 单位：mg/L元素化合物用 量大 量NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2OCaCl2.2H2O16501900170370440微 量KINaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCOCl2.6H2OMnSO4.4

8、H2OZnSO4.7H2OH3BO30.830.250.0250.02522.38.66.2有 机甘氨酸VB1(盐酸硫胺素)VB6（盐酸吡哆醇）烟酸肌醇20.40.50.5100铁 盐FeSO4.7H2ONa2-EDTA.H2O27.8537.25表7 C17培养基配方 单位：mg/L元 素化合物用 量大 量KNO3MgSO4.7H2OKH2PO4NH4NO3CaCl2.2H2O1400150400300150微 量MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KICuSO4.5H2OCOCl2.6H2ONaMoO4.2H2O0.50.255.00.10.0120.0120.012有 机甘

9、氨酸VB1(盐酸硫胺素)VB6（盐酸吡哆醇）烟酸2.01.00.50.5铁 盐FeSO4.7H2ONa2-EDTA.H2O27.8537.30元 素化合物用 量大量元素KNO32527.5MgSO4·7H2O 250NaH2PO4.H2O150CaCl2·2H2O150(NH4)2SO4 134微量元素KI0.75H3BO43.0MnSO4·H2O 10ZnSO4·7H2O 2.0Na2MoO4·2H2O0.25CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O 0.025铁盐Na2-EDTA37.3FeSO4·7

10、H2O27.8有机成分肌醇100烟酸1.0盐酸吡哆醇1.0盐酸硫铵素10表8 B5培养基配方 单位：mg/L实验二 培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基的配制与灭菌的操作方法。对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条

11、件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。二、实验用具和药品托盘天平（感量0.5g）、搪瓷缸、烧杯、三角瓶、量筒、移液管、洗耳球、玻璃漏斗、玻璃棒、pH试纸、蒸汽高压灭菌锅、棉塞（封口膜）、线绳、包头纸。蔗糖、琼脂、1M NaOH、1M HCl、各种培养基母液。三、实验步骤（一）培养基配制 每组配制MS+IBA0.3mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%培养基1000mL。1.称量称取7g琼脂，30g蔗糖备用。2.煮琼脂 取一只搪瓷缸，用量筒量取700mL蒸馏水倒入其中，

12、用记号笔做一个记号，将琼脂放入搪瓷缸中，在电磁炉上加热，直到琼脂条全部融化为止。补充蒸馏水到标记处。3.量取母液 按照培养基母液的浓度计算出应量取的毫升数，然后用量筒和移液管分别量取，放入一个干净烧杯中。计算公式：吸取量 mL=培养基中物质的含量（mg）×1000mL/母液浓度（mg/L） 表9 各种母液吸取量表 单位：（mL）药品名称母液浓度1L培养基母液吸取量0.3L培养基母液吸取量大量元素10倍液  微量元素100倍液  有机物100倍液  铁盐100倍液  IBA1mg/10mL 

13、60;6-BA1mg/10mL  4.补水 将上面量取的母液、称好的蔗糖倒入煮好的琼脂中，然后按照计算补加蒸馏水，制成培养基1000mL。5.调节pH值 用1M NaOH 或1M HCl 调节培养基的pH值，调至5.86.0。6.分装 将配制好的培养基分装到三角瓶中。每个三角瓶倒30mL左右。7.塞棉塞 将三角瓶内口用纱布擦净，塞好棉塞。8.包扎 用包头纸将瓶口包好。（二）培养基的灭菌把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指

14、针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1.11.2kg/cm2时，即121时，维持15分钟。灭菌后要趁热取出三角瓶。培养基自然冷却凝固。放置1 d后再使用。四、作业 完成实验报告。实验三 培养材料的灭菌与接种一、实验目的与意义 培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个很重要的环节。通过实验，领会无菌培养对试验材料消毒、接种的要求，初步掌握材料灭菌、接种的操作技术。二、实验用具和药品超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿、滤纸、毛笔。0.1%氯化汞（升汞）、漂白粉（饱和上清液）、次氯酸钠、70%酒精、灭菌蒸馏水。三、实验材料植物

15、的茎顶、茎段等。四、实验步骤（一）培养基准备 按培养材料的要求，准备好培养基。（二）接种室准备 首先将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于超净工作台上，打开超净工作台紫外灯及送风开关，确认正常送风后，开机30min。接种前关闭紫外灯，用75%酒精棉球擦拭超净台。（三）操作人员准备 穿上白大褂、拖鞋，戴上帽子。用肥皂洗手，特别是将指甲洗净，然后用粘有70%酒精的棉球把手和指尖消毒1次。（四）培养材料的表面灭菌 培养材料的灭菌原则：培养材料的表面灭菌，是组织培养技术的重要环节。培养材料进行表面灭菌时，一方面应考虑到药剂对各类菌种的杀灭效力，从中选择具有高效的杀菌剂；另一方面还应考虑到，植物材料对杀菌

16、剂的耐力，也就是说，不能因选用了强杀菌剂而使植物组织、细胞受到损伤或杀死。至于选用几种药剂进行表面灭菌，灭菌的时间长短，应依据作物种类的不同进行灭菌试验。培养材料的灭菌方法：茎段：从田间选取生长健壮、无病、虫害的幼嫩枝条，去掉叶片、叶柄，在流水下用毛笔沾洗涤液刷洗干净，剪成小段，用滤纸吸干材料表面的水分，横放于烧杯中。向烧杯中倒入70%酒精，摇动两三下（不超过30秒），立即将酒精倒出，然后倒入0.1%升汞溶液，浸泡810min（在超净工作台上）。浸泡过程中不断摇动，保证材料充分接触药剂，然后在超净台上用灭菌蒸馏水洗三次，用无菌滤纸吸干水分，接种。（五）解除三角瓶上捆扎包头纸的线绳，把三角瓶按培

17、养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用70%酒精棉球把接种台面擦一遍（清除尘粒）。（六）将接种所用的剪刀、大小镊子等，用70%酒精棉球擦拭一编，在酒精灯火焰上灼热灭菌。灭菌后放在灭过菌的培养皿中。（七）轻轻打开包头纸，去掉瓶塞，将三角瓶口在酒精灯火焰上方灼烧灭菌，然后放在酒精灯右侧。（八）材料的切割芽培养 用镊子取出嫩茎置于培养皿内，重换一把镊子，剥去芽上的鳞片，切下1cm长带一个芽的茎段，芽最好位于芽段中央，将芽段放入三角瓶内的培养基上（注意芽不要插入培养基内）。（九）材料的置床在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手用镊子在培养基表面将培养材料摆放均匀（芽段平放于培养基上，注意芽的部位向上，用镊子

18、将芽段轻轻向下按一下，使枝段的一半进入培养基）。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。塞上棉塞，用包头纸封口，注明材料名称、培养基代号、接种日期、姓名等。注意：在超净台接种时，应尽量避免空气流动（如说笑、打喷嚏、走动等动作），以免造成污染。五、作业 接种后的污染调查接种一周后，调查污染情况并将调查结果填入表内：观察日期接种日期接种数（瓶）污染数（瓶）污染率（%）主要污染菌种实验四 小麦成熟胚离体培养一、实验目的与意义种胚离体培养技术是植物有性杂交育种，特别是远缘杂交育种的重要辅助手段，本实验的目的是学习和掌握小麦成熟胚离体培养的操作技术。小麦的组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为小麦遗

19、传转化操作的主要技术基础，一直受到广泛关注。前人已采用过小麦的多个部分如根、茎、叶、幼穗、幼胚和成熟胚等为外植体，研究了其愈伤组织细胞的分化再生情况，发现幼穗和幼胚愈伤组织具有较高的再分化能力。但幼穗，幼胚的采用受季节限制，而种子保存期长，易获得，可用于较长时间的研究。只是成熟胚脱分化能力较弱，愈伤组织再分化能力差，但如果能改变种子的生理状态，提高其胚性愈伤组织的形成能力，无疑将大大促进小麦胚性细胞系的建立。低温处理具有促进种子从体眠状态转向萌发状态的效应。低温处理对小麦成熟胚愈伤组织的形成也有一定影响，可以提高其愈伤形成和分化能力。二、实验用具和药品高压蒸汽灭菌器、超净工作台、镊子、酒精灯、

20、棉球、烧杯、广口瓶、三角瓶、培养皿。MS培养基母液、2,4-D、6-BA、KT、吲哚乙酸(IAA)、腺嘌呤、天冬氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂。三、实验材料小麦种子四、实验步骤（一）培养基的制备诱导培养基：MS+ 2,4-D2 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。继代培养基：MS+ 2,4-D 1 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白300 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。分化培养基：MS+6-BA 2m g/l+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。小

21、苗培养基:MS +NAA0.2m g/1+腺嘌呤40m g/l+蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。生根壮苗培养基：1/2 MS +NAA0.5m g/1 +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。（二）无菌材料的获得将小麦种子在4冰箱中充分吸水，用吸水纸吸干水分，在超净工作台上用75%乙醇浸泡1 min，再用0.1% HgCl2浸泡10 min，无菌水冲洗3次，放入培养皿备用。（三）接种用解剖刀将种胚切下，并将胚用镊子轻轻夹破，盾片朝上，分别接种在不同类型的培养基上培养。或直接用手拿种子，用镊子剥取成熟胚接种到培养基，然后用长镊子将盾片朝上。每瓶接种十个左右成熟胚。（四）培养培养温度25

22、7;1，每天光照12h。愈伤组织诱导用散射光。2周后统计出愈率：出愈率=产生愈伤数/接种成熟胚总数×100%（五）继代将胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养。（六）分化 将愈伤组织转移到分化培养基，愈伤组织分化光照强度15002000lx，统计分化率：分化率=产生绿色芽点愈伤数/接种愈伤数×100%（七）小苗培养将有绿芽的愈伤组织转接到小苗培养基上进行芽苗诱导和伸长。（八）壮苗培养在无菌条件下取出绿苗，转入壮苗培养基中培养。（九）炼苗打开瓶口，在培养间炼苗23d，转到自然条件下炼苗23d。（十）移栽洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里。成活后移栽到大田。五、作业每人剥取10

23、枚种胚、接种于培养基上，12周后观察培养结果。实验五 植物人工种子制作一、实验目的与意义了解植物人工种子的意义，掌握人工种子的制作方法。二、实验用具和药品超净工作台、电子天平、小烧杯、不锈钢药勺、玻璃棒。海藻酸钠、氯化钙、MS培养基成分。三、实验材料 带腋芽植物幼嫩枝条。四、实验步骤（一）海藻酸钠的制备：每组称4克海藻酸钠，放入100mLMS培养液中，用玻璃棒不断搅拌，直到均匀为止，即配成4%的海藻酸钠溶液，灭菌备用。（二）CaCl2溶液的制备：称量2克CaCl2溶解于100mL蒸馏水中，配成2%的CaCl2溶液，灭菌备用。（三）接种室准备：首先将接种用具、培养基等置于超净工作台上，打开超净工

24、作台紫外灯及送风开关，确认正常送风后，开机30min。接种前关闭紫外灯，用75%酒精棉球擦拭超净台。（四）操作人员准备：穿上白大褂、拖鞋，戴上帽子。用肥皂洗手，特别是将指甲洗净，然后用粘有70%酒精的棉球把手和指尖消毒1次。（五）材料消毒：从田间选取生长健壮、无病、虫害的幼嫩枝条，去掉叶片、叶柄，在流水下用毛笔沾洗涤液刷洗干净，剪成小段，用滤纸吸干材料表面的水分，横放于烧杯中。在超净工作台上，向烧杯中倒入70%酒精，摇动两三下（不超过30秒），立即将酒精倒出，然后倒入0.1%升汞溶液，浸泡810min。浸泡过程中不断摇动，保证材料充分接触药剂，然后在超净台上用灭菌蒸馏水洗三次，用无菌滤纸吸干水

25、分，备用。（六）制作人工种子：将幼嫩植物茎段剪成带腋芽的小段，混合入海藻酸钠溶液中进行包裹，然后用灭菌的不锈钢小勺将其舀出来，震动手臂，将裹有海藻酸钠的小茎段迅速滴入CaCl2溶液中，进行离子交换反应。反应10min，形成小圆球。用灭菌蒸馏水冲洗小圆球，终止离子交换反应，这时的小圆球具有弹性，又不坚硬。即为人工种子。五、作业完成实验报告。实验六 愈伤组织的诱导与增殖 一、实验目的与意义学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形

26、成。二、实验用具和药品超净工作台、镊子、剪刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿、滤纸、毛笔、无菌水。70%酒精、0.1%氯化汞（升汞）三、实验材料植物的叶片。四、实验步骤（一）培养基准备 按培养材料的要求，准备好培养基。（二）接种室准备 首先将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于超净工作台上，打开超净工作台紫外灯及送风开关，确认正常送风后，开机30min。接种前关闭紫外灯，用75%酒精棉球擦拭超净台。（三）操作人员准备 穿上白大褂、拖鞋，戴上帽子。用肥皂洗手，特别是将指甲洗净，然后用粘有70%酒精的棉球把手和指尖消毒1次。（四）培养材料的表面消毒 培养材料的消毒原则：培养材料的表面消毒，是组织

27、培养技术的重要环节。培养材料进行表面消毒时，一方面应考虑到药剂对各类菌种的杀灭效力，从中选择具有高效的杀菌剂；另一方面还应考虑到，植物材料对杀菌剂的耐力，也就是说，不能因选用了强杀菌剂而使植物组织、细胞受到损伤或杀死。至于选用几种药剂进行表面消毒，消毒时间的长短，应依据作物种类的不同进行试验。培养材料的消毒方法：从田间选取生长健壮、无病、虫害的幼嫩植物叶片，在流水下用毛笔沾洗涤液刷洗干净，用滤纸吸干材料表面的水分，放于烧杯中。向烧杯中倒入70%酒精，摇动两三下（不超过30秒），立即将酒精倒出，然后倒入0.1%升汞溶液，浸泡810min（在超净工作台上）。浸泡过程中不断摇动，保证材料充分接触药剂

28、，然后在超净台上用灭菌蒸馏水洗三次，用无菌滤纸吸干水分，接种。（五）解除三角瓶上捆扎包头纸的线绳，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用70%酒精棉球把接种台面擦一遍（清除尘粒）。（六）将接种所用的剪刀、大小镊子等，用70%酒精棉球擦拭一编，在酒精灯火焰上灼热灭菌。灭菌后放在灭过菌的培养皿中。（七）轻轻打开包头纸，去掉瓶塞，将三角瓶口在酒精灯火焰上方灼烧灭菌，然后放在酒精灯右侧。（八）材料的切割与接种将叶片用剪刀剪成0.5cm见方的小块，平铺于培养基表面，每瓶均匀放置4块。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。塞上棉塞，用包头纸封口，注明材料名称、培养基代号、接种日期、姓名等。

29、注意：在超净台接种时，应尽量避免空气流动（如说笑、打喷嚏、走动等动作），以免造成污染。五、作业 接种2周后，调查污染情况并将调查结果填入表内：观察日期接种日期接种数（块）污染数（块）污染率（%）主要污染菌种 实验七 花粉发育时期的鉴定一、实验目的与意义花药和花粉离体培养中，花粉的发育时期是提高花粉植株诱导率的重要因素。准确地鉴定花粉的发育时期。做到适期及时地接种是花粉、花粉离体培养中十分重要的操作技术。本实验的目的是学习花粉发育时期的镜检技术，同时识别关键时期的细胞学特征。二、实验用具和药品显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、酒精灯、滤纸、醋酸-洋红液、或卡宝品红液。三、实验材料小麦各发育时

30、期的花蕾。四、实验步骤取固定液中花药一个，置于载玻片上，用吸水纸吸去固定液，滴上一滴醋酸洋红液，用解剖针在染色液中将花药轻轻压碎，目的是使花粉从药囊中游离出来。然后弃去药壁残渣，盖上盖玻片。在酒精灯火焰上迅速来回轻烤几次。目的是破坏染色质，促使细胞核着色，同时驱赶气泡。可随时用手背试测温度，注意不可过热或煮沸，待制片冷却后，可在显微镜下检查。五、花粉发育时期的特征四分孢子期：花粉经过减数分裂后，形成的连接在一起的四个小孢子。显微镜检时，在一个平面上往往只能看到三个小孢子及小孢子核。在同一个平面上看到四个小孢子及小孢子核的情况较少。单核期：又分单核早期、单核中期和单核晚期。单核早期：细胞体积较小

31、，相比之下核显得大、核位居正中，细胞质没有液泡化。单核中期：细胞体积增大至正常大小。细胞质中开始出现小液泡，细胞核开始向边缘移动。单核晚期：胞质中小液泡连成大液泡。核被挤到边缘靠近细胞壁。这一时期也称单核靠边期。双核期：单核小孢子第一次有丝分裂后，形成两个形态、大小不同的子核。一个是染色质松散、染色较浅的营养核。另一个是染色质紧密，染色较浓的生殖核。三核期：三核期由于淀粉的大量累积，细胞核内状况不易观察。二核型花粉生殖核的分裂往往要在花粉发芽之后才能见到。六、作业（一）认真镜检花粉各发育时期，特别是该种植物花药离体培养时常用的花粉发育时期。（二）每人用绘图纸绘出单核早期、单核晚期、双核早期细胞

32、图各一张。（注意绘图时细胞直径不小于3cm）。实验八 植物花药培养一、实验目的与意义掌握花药离体培养的一般方法和实际步骤，理论联系实际。通过实验加深对理论知识的理解。利用离体培养花药的方法，诱导形成单倍体的工作始于1964年。单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目和配子体细胞的染色体数目一致，因此可以从其表型观察基因型。利用这一特点在杂交育种中可以提高选择效率，避免误选和漏选。对单倍体植物进行染色体人工加倍之后即可得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分离，缩短育种年限，加快育种速度。二、实验用具和药品超净工作台、冰箱、眼科镊子、接种环、酒精棉球、纱布、酒精灯、三角瓶。95%酒精；75%

33、酒精；培养基（准备好的）。三、实验材料小麦适期（单核中晚期）的花蕾。四、实验步骤（一）培养基准备 接种前准备好适合小麦花药培养的培养基，放置3天。（二）取材及预处理 从田间选取花粉粒处于单核中晚期的小麦穗子（其外部形态为旗叶叶耳和倒二叶叶耳距离约为810cm，视品种而定），从第二节处折断，剪去叶子，只留下叶鞘包裹的穗子，用湿纱布包好，罩上塑料袋，放在4冰箱低温处理23天。（三）接种室准备 首先将接种用具、培养基等置于超净工作台上，打开超净工作台紫外灯及送风开关，确认正常送风后，开机30min。接种前关闭紫外灯，用75%酒精棉球擦拭超净台。（四）操作人员准备 穿上白大褂、拖鞋，戴上帽子。用肥皂洗

34、手，特别是将指甲洗净，然后用粘有70%酒精的棉球把手和指尖消毒1次。（五）整穗 将麦穗从第一节处折断，紧挨旗叶叶耳下方用剪刀将旗叶剪掉。（六）材料消毒 用70%酒精棉球将整好的麦穗擦拭两遍，放入用棉球擦过的大培养皿内。（七）接种 点燃酒精灯，将镊子、剪刀、接种环等用酒精灯灼烧灭菌，待镊子降温后，剥取小花内的花药接种于培养基上，每瓶接种80100枚花药，摆放均匀。（八）包扎 将棉塞和三角瓶的瓶口用酒精灯烧一下，塞上棉塞，用纸包好。用记号笔在瓶壁上记录接种日期、材料名称、接种者姓名等。（九）培养  接种后将培养瓶置于散光，2528条件下诱导愈伤组织。四、作业1.调查培养情况；接种日期接种

35、数（瓶）污染数（瓶）污染率（%）主要污染菌种调查日期2.完成实验报告。实验九 植物原生质体的游离和融合一、实验目的与意义原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。原生质体在离体培养条件下，具有再生新壁、连续进行细胞分裂并再生完整植株的能力。原生质体由于消除了细胞壁的障碍，故是遗传操作、基因转化的好材料。同种和异种原生质体还可以诱导融合，产生同核体和异核体，实现细胞杂交。本实验是学习和掌握利用酶解法，脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法。同时用化学诱导剂，诱发原生质体的融合，借助倒置显微镜。观察融合的过程。二、实验用具和药品（一）仪器设备及用具 超净工作台、倒置显微镜、离心机、离心管、高压灭菌锅、细菌过滤器

36、、不锈钢网（80100m）、50mL三角瓶、直径6cm的培养皿、50mL烧杯、吸管、注射器、长注射针头、刀片、镊子、酒精灯、血球计数板、刻度滴管等。（二）药品（1）酶液（游离向日葵下胚轴原生质体）组成纤维素酶（OnozukaR-10） 1.5%果胶酶 0.5%半纤维素酶 0.2%离析酶 （MacerozymeR-10） 0.4%甘露醇 0.4mol/LCaCl2.2H2O 0.5mol/LMES（2-N-吗啉乙烷磺酸） 0.1%pH值（5.56.0） 5.8上述混合液用0.45m微孔滤膜过滤灭菌。（2）酶液（游离向日葵子叶原生质体）组成纤维素酶 2%果胶酶 1%山梨酶 0.65mol/LCaC

37、l2.2H2O 0.05mol/LMES 0.1%pH值（5.66.0） 5.8上述混合液用0.45m微孔滤膜过滤灭菌。（3）0.16mol/L CaCl2.2H2O加0.1% MES，pH值5.8。（4）17%和22%的蔗糖水溶液，pH值5.0。（5）灭菌蒸馏水。（6）融合用试剂： 聚乙二醇（PEG）：取分子质量为6000u，配成40%的水溶液。 高钙、高pH值洗液：CaCl2.2H2O 0.1mol/L山梨酸 0.1mol/LTris 5mL/100mL 1mol/LpH值 9三、实验材料分离原生质体所用的材料，可取植物的幼嫩根、茎、叶片和幼果，或者用它们的培养细胞和愈伤组织。原生质体的分离效果，与材料来源和酶液的组分有关。同时，还受植株年龄、生理状态、生态环境的影响，没有标准通用的方法。本实验用向日葵子叶或向日葵下胚轴或烟草叶片为实验材料。四、实验步骤（一）原生质体制备1. 将向日葵材料用水冲洗干净，用0.1%HgCl2浸泡12min，其间不时摇动。然后倒出HgCl2液，用灭菌水冲洗5次。再用刀片切下下胚轴，撕去表皮，切成小块放入酶液中。同时，撕去子叶的下表皮，切成小块放入酶液中。每10mL酶液中约放2g