四逆汤超微颗粒与传统饮片的毒性对比研究

1、项目类别药学类科技论文广州中医药大学第二临床医学院学生科研创新基金课题立 项 申 请 书 课题名称：四逆汤超微颗粒与传统饮片的毒性对比研究申 请 者：刘嘉梦 所在年级：08级 通讯地址：广州中医药大学大学城校区学生宿舍D233 电 话： E-MAIL： 申请日期：2010-5-4指导老师：侯少贞广州中医药大学第二临床医学院二0一0年制填 报 说 明一、广州中医药大学第二临床医学院科研创新基金课题旨在提高二院学生科技学术水平、创新精神、创新意识及创新能力，以增强我院的学术氛围。二、申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现

2、的缩写词，须注出全称。三、申请书为十六开本，复印时用A4复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式三份（至少一份为原件），由所在年级办审查签署意见后，上报二院学工办。四、封面右上角项目类别由申请者填写，项目类别分为三类：医学类科技论文、药学类科技论文、发明制作及社科类调查报告。五、所有中标作品必须按规定时间报送。六、为了保证课题质量，所有申报课题必须具有一位以上（含一位）课题相关领域的的具有讲师以上资格的老师推荐，推荐意见必须填写在课题申报表的指定位置处。无专家推荐意见或发现弄虚作假者取消评审资格。一、简表申报者情况姓名刘嘉梦性别女出生年月1990年5月现学历（ B ）

3、A.大专 B.大学本科 C.七年制专业中医学年级08级学制5年制入学年月08年9月申报作品全称四逆汤超微颗粒与传统饮片的毒性对比研究通讯地址广州中医药大学大学城校区学生宿舍D233邮编561000电话 合作者情况姓名性别年龄学历所在学校院系年级项目分工黄泓慧女20大学本科二院08级负责查找文献，实验方面与及经费管理方面的工作说明：必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）研究内容和意义摘要（180字以内）中药超微颗粒是将饮片粉碎成超微粉，按中医处方配药，直接冲服的一种新型饮片。然而，有毒中药超微颗粒中的有毒成分能否被其他配伍药物所制约是一

4、个未知数。本项目以四逆汤为研究对象，测定四逆汤超微颗粒与传统煎剂中乌头碱类有毒成分的含量，结合急性实验，分析毒性效应-毒性成分含量的关系。该实验有助于判断四逆汤超微颗粒取代传统煎剂的可行性，为有毒中药超微颗粒的应用提供参考信息。主题词1.主题词数量不多于三个； 2.主题词之间空一格（英文用/分隔）中文（20字以内）四逆汤传统煎剂 四逆汤超微颗粒 毒性英 文Sini traditional decoction /Sini ultrafineparticle /Toxicity二、研究现状（包括国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际、国内科学现状分析，论述项目的科学意

5、义；对应用基础及应用研究，着重结合学科前沿，围绕临床诊疗实际和潜在的社会、经济发展趋势，论述其应用前景。（无论是基础、应用基础或应用研究都要提出明确的工作假说，要阐明与以往研究有何不同）一、中药超微颗粒的应用优势随着社会经济的发展、科学技术的进步和患者需求的不断提高，中药传统饮片煎剂的弊端日益明显，如煎煮费时、携带不便、质量不稳定、卫生状况不理想等缺点，使得中药汤剂越来越难以适应现代社会快节奏的生活方式和临床应用的需要。中药超微颗粒的出现是中药现代化的一场革命。它是采用现代技术对传统饮片进行加工，将中药饮片粉碎成超微粉，按中医处方配药，不需煎煮，直接冲服的一种新型饮片【1,2】。其特点是饮片经

6、粉碎成超微粉，细胞基本都已破壁，冲服不仅保留了原饮片的全部成分，且所含成分易于溶出和吸收，可在提高有效成分生物利用度的基础上，降低处方用药剂量，节约资源，便于服用3,4。目前，有很多研究展示，中药超微颗粒的药效优于传统饮片。吴玉生等【5】通过临床观察发现：水蛭微粉较水蛭粗粉更能有效地抑制脑梗死患者血管内皮损伤、血小板活化，能有效提高脑梗死患者的临床疗效。杜晓敏【6】通过试验发现桂附地黄超微颗粒在药效学方面明显优于传统桂附地黄饮片。蔡光先【7】等进行28味常用中药（人参,黄芪,白术,山药,白芍等）饮片与散剂中用量的研究中发现达到同种药效时，超微颗粒的用量最少。中药超微颗粒的实现为中药的现代化发展

7、提供了一个很好的平台，有着与传统煎剂所没有的优势【1013】：提高中药的溶出度；提高药物的生物利用率；增强中药的药效；减少剂量，节省原料，提高效率，降低成本；“固体乳化”作用(使中药材各有效成分均匀化)；提高中药的压片和造粒性能，服用口感好，便于应用；有利于保留生物活性成分；有利于实现中药现代化。在临床使用中,人们常把一些名贵的药材,如高丽参,鹿茸,灵芝等打成粉末状,增强了疗效的同时也减少了剂量,节省了原材料。二、有毒中药超微颗粒应用中面临的问题然而中药超微颗粒在推广应用中也面临着一些问题，特别是在毒副反应方面。含毒性成分的药物，超细粉碎、现代化提取有可能使其毒性增加，影响用药安全性。并且复方

8、合煎汤液并不是各味药或各成分的简单组合，一些含毒性成分可能是在配伍煎煮过程中达到一定条件时产生新化合物而使中药毒性降低。如半夏泻心汤中，生姜与半夏合煎时，生姜能减轻或消除生半夏的毒副作用；四逆汤中甘草与附子合煎时，甘草能减轻附子的毒副作用，等等。而如果只是把各味药简单的混合一起后用开水冲泡，该条件未必适合毒性成分反应的条件，那么中药的毒性可能不会因此而降低。因此对于这种用配伍来减毒或制约毒性的方剂，中药超微颗粒能否代替中药饮片传统煎法，能否广泛的适用于临床，还需要进一步做化学成分、毒理学等方面的对比研究，为临床提供更多的科研数据和确切的科研依据。四逆汤做成超微颗粒后，据周于禄等【18】人研究，

9、四逆汤超微颗粒与2倍其剂量的传统饮片四逆汤对豚鼠心脏的药理作用、有效成分乌头碱含量相比未见明显。也就是说，四逆汤超微颗粒的药效远远优于传统饮片。四逆汤作为临床常用药，若四逆汤超微颗粒能够广泛应用于临床，将为患者减少了很多麻烦，也可以减少因为附子煎煮时间不足而引发毒副作用的情况。四逆汤中的附子为大辛大热大毒之品，稍不慎使用，将引发严重的肝、肾毒性反应，甚者会导致死亡。在传统煎法中，附子先煎后与炙甘草、干姜共煎。有研究证明,在附子与干姜、炙甘草合煎时，附子中有毒物质乌头碱的含量随甘草剂量增加而减少，说明甘草具有解附子毒的作用14。杨学伟15等认为其机制可能是在煎煮过程中，甘草中的甘草次酸与乌头碱形

10、成的络合物可降低乌头碱的毒副作用；廖晖16认为甘草可能的解毒途径为:药材甘草与附子同煎，乃至四逆汤全方通过煎煮，使乌头碱类含量下降，整方的毒性降低；杨明17认为甘草对减毒机理主要表现为甘草中的酸性物质与附子中的酯型生物碱的沉淀反应以及甘草的肾上腺皮质激素样作用。刘红霞【19】用傅里叶变换红外光谱(FT限)技术对不同配伍方式的四逆汤水煎液进行了研究，得出不同配伍方式样品的红外谱图特征具有一定的变化规律；同时也就说明四逆汤药理方面与甘草与附子成分相互反应了多少有关。据目前的资料来看，无论是基于何种看法，都表明在共煎的过程中，甘草对降低附子的毒性，起到了很大的作用。而相对比下，超微颗粒饮用时仅仅以开

11、水冲泡十到二十分钟，没有共同加热、混合的过程，附子超微颗粒中的有毒成分能否能被甘草超微颗粒所制约是一个未知数。有关四逆汤超微颗粒的毒性如何，目前尚未有相关的研究结果见诸于报。基于以上分析，本研究选择以“四逆汤”为研究对象，拟进行动物实验比较四逆汤超微颗粒与四逆汤传统煎法中的毒性，并采用高效液相法（HPLC）检测两者中有毒成分（乌头碱）的水平；结合毒性实验结果，分析四逆汤超微颗粒及四逆汤传统煎剂的毒性效应毒性成分的关系。若取得预期效果，该项目的完成有助于进一步判断临床上四逆汤超微颗粒取代四逆汤传统煎剂的可行性，也为其它有毒中药超微颗粒的应用提供参考信息。参考文献1 蔡光先，杨永华中药饮片改革的新

12、探索单味中药超微饮片J湖南中医杂志，2001，6：502 汪文涛.中药超微饮片质量控制与安全性探讨. 世界科学技术一中医药现代化质量控制,2004,6(3):3740.3 汪涛，孙亮，粱蓉梅，宓鹤鸣. 中药超微粉碎的研究进展与应用前景. 药学实践杂志,2007,25(3):129133.4 赵凤存，刘怡菲，吴占军，王 菊，李瑞英. 中药超微粉碎技术的研究进展与思考. 河北农业科学,2007,11(1):100102.5 吴玉生，张文高，等水蛭微粉对急性脑梗死血管性假血友病因子、血小板a一颗粒膜蛋白140水平的影响J山东中医药大学学报，2007，31(1)：23256 杜晓敏, 郭琪,何煜.中成

13、药传统制剂与超细微粉制剂的药效学比较. 中成药,2000,22(4):307309.7 蔡光先，刘柏炎. 28味常用中药饮片汤剂与散剂中用量的研究. 中国实验方剂学杂志,2004,10(2):6364.8 杨学伟,崇卓,郭云良.四逆汤作用机制的研究. 国际中医中药杂志.2006 28(1)3334.9 黑子清，孙惠兰，等四逆汤对高胆固醇喂饲所致动脉粥样硬化形成和氧化损伤的影响中国动脉硬化杂志2003,11(6)：505508.10 杜晓敏，郭琪，何煜原生药材超细微粉制剂的药效学研究J中草药，1999，30(9)：68011 杜晓敏，刘璐，何煜原生药材超细微粉制剂的药效学研究J中草药。1999，

14、30(9)：680一68412 关走增，雷敬卫，郑艳丽浅谈超微粉碎J中国中药杂志，2002，27(7)：49913 李春萌。盖国胜粉体技术在中药中的应用J 中国粉体技术，2004。10(3)：485014 裴妙荣，王世民，李晶四逆汤中甘草对附子解毒作用的相关性分析中国中药杂志， 1996，21(1)：5052.15 杨学伟,崇卓,郭云良. 四逆汤作用机制的研究. 国际中医中药杂志,2006,28(1):3336.16 廖晖. 四逆汤中甘草作用分析. 时珍国医国药,2001,12(3):272273.17 杨明,刘小彬,黄庆.附子甘草配伍减毒增效机理探析. 时珍国医国药,2003,14(4):1

15、97198.18 唐铭翔 ，周知午 ，曾嵘 ，周于禄. 四逆汤超微颗粒与传统饮片对离体豚鼠心脏作用的比较研究. 湖南中医学院学报,2006,26(1):37.19 刘红霞,孙素琴,杨峻山. 现代红外光谱技术用于复方四逆汤的配伍研究. 光谱学与光谱分析,2007,27(7):13161318.20 毛泉明,张钰泉,叶福媛,等. 高效液相色谱法测定银翘解毒片中绿原酸含量. 黑龙江医药,1997,10(1):1921.21 刘筱蔼，吴伟康，颜建云，罗汉川. 四逆汤煎剂和缓释片剂的毒性比较. 药产生资讯，2006，3（20）：134135.22 张梅,张艺,杨顺荣,等.高效液相谱法测得生脉注射液中人参

16、皂甙Rb 的含量. 中国中药杂志,1996,21(11):673674.三、研究方案1 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：通过研究四逆汤超微颗粒与四逆汤传统煎剂的毒性，进行对比，判断临床上四逆汤超微颗粒取代四逆汤传统煎剂的可行性，也为其它有毒中药超微颗粒的应用提供参考信息。研究内容：基于以上分析，本研究选择以“四逆汤”为研究对象，拟进行动物实验比较四逆汤超微颗粒与四逆汤传统煎法中的毒性，并采用高效液相法（HPLC）检测两者中有毒成分的水平；结合急性毒性实验结果，分析四逆汤超微颗粒及四逆汤传统煎剂的毒性效应毒性成分含量的关系。拟解决的关键问题：药材的处理，药液的制备，药量的选择 ，病

17、理切片的分析。2拟采取的研究方法、技术路线及实施方案（含研究参照的各种标准、实施步骤、协作方式与实施的具体要求等）研究方法： 采用高效液相色谱仪检测四逆汤超微颗粒及传统饮片煎剂中乌头碱类毒性成分的含量。 通过小鼠急性毒性预实验，初步判断四逆汤超微颗粒及传统饮片煎剂的毒性大小。 根据项预试验结果的最大毒性剂量，通过正式试验分别测定四逆汤超微颗粒及传统饮片煎剂的LD50或最大耐受量(MTD)。 结合、项实验结果，分析四逆汤超微颗粒及四逆汤传统煎剂的毒性成分水平毒性效应的关系。实验方案：1. 采用HPLC法测四逆汤传统煎剂、现代超微颗粒的毒性水平：1.1 对照品溶液的制备：精密称取乌头碱lmg、中乌

18、头碱1.1mg和次乌头碱09mg，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密吸取上述溶液005mL、02mL、04mL、08mL、16mL分置15只10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声震荡、摇均后用超微滤膜滤过，收集滤液备用。1.2 线性关系实验 分别精取上述对照品溶液各5ul进样，测定峰面积值。以峰面积值为纵坐标，相应的浓度为横坐标，求得回归方程。 1.3 四逆汤传统煎剂溶液，四逆汤超微颗粒溶液的制备：四逆汤传统煎剂溶液：按照2010年版药典制备传统四逆汤煎剂的供试品溶液，记录四逆汤溶液的容积。四逆汤超微颗粒溶液：按传统饮片四逆汤各单味药比例组方1，药量为传统饮片的1/2制备溶液2，同时记录

19、其容积并按照上述制备方法制成四逆汤超微颗粒的供试品溶液。1.4 被测溶液含乌头碱类水平的测定：取所制备的上述两种溶液各5ul进样，记录高效液相色谱图。根据各图谱中3种乌头碱的峰面积，由上述3个回归方程算出各样品中3种乌头碱的浓度，重复3次取平均值。并计算上述两种溶液中3种乌头碱的总含量。2.用动物急性毒性试验实验反应来评价其毒性差异： 2.1 预试实验： 2.11 查阅文献中与两种受试物的类似物LD50；分别以3倍之差的三个剂量组进行预实验，每组3只小白鼠，分别求出小白鼠全活、全死剂量(或者找出引起动物5%(Dn)和95%(Dm)死亡的剂量)。 2.12 若药液在最大浓度、最大给药容量下也没有

20、达到全死或95%的死亡数，不能求得两种受试物的全死剂量，则分别求其最大耐受量(MTD)。2.2 正式实验： 根据预实验的实验结果，若能求得小白鼠的全活、全死剂量则进行A实验。若求的是最大耐受量，则进行B实验。A急性毒性LD50实验：取小白鼠100只，随机分传统煎剂组与超微颗粒组各50只，在预实验的全活全死剂量之间设5个剂量组，各组间按1.5等比级数设计；选用灌胃给药，观察观察小白鼠两周内的一般情况，死亡情况以及死亡时间。分别计算两组的LD50。B最大耐受量实验：取小白鼠60只，随机分传统煎剂组与超微颗粒组各30只，分别用最大耐受剂量灌服两组小白鼠，观察小白鼠的一般情况，死亡情况以及死亡时间，并

21、且进行动物的大体解剖，任何器官出现体积，颜色，质地等改变时均做记录并进行组织病理学检查。3. 用HPLC法检测两者中有毒成分的含量后结合急性毒性实验结果，分析四逆汤超微颗粒及四逆汤传统煎剂的毒性效应毒性水平的关系（即剂量-质反应关系）。若在急性毒性实验中，乌头碱浓度高的小鼠死亡率也相应高，表明存在剂量-质反应关系。文献参考：1 国家药典委员会， 中华人民共和国药典：一部S.北京：化学工业出版社， 2005,422-423. 2 蔡光先,刘柏炎.2 8味常用中药饮片汤剂与散剂中用量的研究J.中国试验方剂学杂志,2004,l0(2):63-64. 3 研究计划及预期进展（含阶段目标）研究工作进展：

22、日期 主要工作20109 准备实验材料和器材201010拟采用HPLC法测出乌头碱的峰面积，分别计算出四逆汤传统煎剂、现代超微颗粒的毒性。201011 进行急性毒性预试验20111112进行急性毒性试验201112 整理数据及论文撰写20113 完成论文，结题预期结果：测定出四逆汤超微颗粒及四逆汤传统煎剂的毒性，并且由动物实验分析出毒性效应毒性成分的关系，写出关于四逆汤超微颗粒能否代替传统饮片和临床应用的论文，并提供与此研究有关的信息。4可行性分析（含协作的保障措施）药液的制备，仪器的使用有文献可寻。且对于中药安全性评价、药物不良反应临床研究、中药毒理学与药理学等研究具有良好的工作基础，能为试

23、验顺利进行提供保障。5本项目的创新之处及预期研究成果四逆汤传统饮片在共煎的过程中，甘草中的成分能与附子中的毒性物质发生反应，起到抑制附子的毒性，降低汤剂的毒副作用的作用。相对比下，四逆汤超微颗粒是对每一味药进行分开煎煮后制成各味药的颗粒，服用时只需将颗粒混合用开水冲泡十来分钟，没有进行混合后的煎煮。这种情况下甘草中的成分能否制约附子的毒性，目前尚未有相关的研究结果见诸于报。因此本次研究的特色和创新之处在于研究四逆汤超微颗粒在开水冲泡时，附子的毒性能否被甘草所制约。四、研究工作基础1 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩中药学院的“国家中医药管理局中药药效学评价三级实验室”，拥有一个高层次、配套化的现代中药研究开发体系。对于中药安全性评价、药物不良反应临床研究、中药毒理学与药理学等研究具有良好的工作基础，能为试验顺利进行提供保障。2 已具备的研究条件，尚缺少的研究条件和拟解决的途径项目的实验研究将全部安排在中药学院的实验室完成，实验室已具备本项目研究所需要的基本条件。而对于切片的制作，将委托形态研究教研室的老师。3 申请者和项目主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在项目中承担的任务。学历在项目中承