4细胞基本培养技术

1、 第四章第四章 基本培养技术基本培养技术内内 容容第一节第一节 玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒第二节第二节 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求第三节第三节 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术v清洗：自来水洗，烘干清洗：自来水洗，烘干 泡酸泡酸 自来水洗自来水洗 去离子水洗去离子水洗 三蒸水洗三蒸水洗 烘干烘干v 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。v酸液（洗液）：浓硫酸酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾重铬酸钾二、包装：二、包装：目的：以便消毒及储存，防

2、止落人灰尘及消目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。毒后再次被污染。 包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！品名称、消毒日期等！ 各种用品的包装各种用品的包装器皿的包装分为半包装和全包装器皿的包装分为半包装和全包装v培养瓶培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。v吸管吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。v青霉素小瓶青霉素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。倒扣在饭盒中，全包。v滤器滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。v大

3、的容器大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。如锥形瓶，加上棉塞后半包装。v枪头、枪头、epep管管 装在相应的盒子中，全包。装在相应的盒子中，全包。v手术器械手术器械 放在饭盒中，全包。放在饭盒中，全包。v离心管离心管 加盖子后全包加盖子后全包三、消毒、灭菌三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微消毒灭菌（将已存在的微生物去除）生物去除）灭菌灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。生物、非病原微生物和芽胞。 消毒消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只应用理化方法杀死微生

4、物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。无菌无菌germ free：没有活菌。：没有活菌。防腐防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。生物生长繁殖。抑菌（抑菌（bacteriostasis）：）：抑制体内或体外细抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素 1、消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法 物理方法物理方法: : 湿热（高压蒸汽）、湿热（高压蒸汽）、干热、干热、紫外线。紫外线。射线、过滤、射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。

5、 化学方法化学方法: :使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。物。 2、消毒灭菌的注意事项、消毒灭菌的注意事项 干热消毒：干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到一般在烤箱中进行，需加温到 160160，保持保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。方能杀死芽孢。注意！注意！消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。事故。湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。消毒。v 注意：注意

6、：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。、不能装太满，保持消毒器内气体流通。 2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！后消毒器内的残留冷空气排出！ 关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。3、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是的要求是 15磅磅 20 min；v常规使用液体：消毒常规使用液体：消毒 15磅磅 15 min 。4、橡胶和塑料用品橡胶和塑料用品 ： 如滤

7、器、如滤器、epep管、离心管等高压管、离心管等高压1010磅磅15 min15 min。 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为3030分钟分钟2 2小时左右。小时左右。过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。3、常用设施的消毒及灭菌、常用设施的消毒及灭菌v培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸v台面：紫外线照射、台面：

8、紫外线照射、 70%乙醇擦拭乙醇擦拭v培养箱：新洁尔灭擦拭培养箱：新洁尔灭擦拭v培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌灭菌v滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高包好高 压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌v培养板：紫外线照射培养板：紫外线照射12小时以上。小时以上。v培养基：过滤除菌培养基：过滤除菌、 第二节第二节 培养操作基本要领和要求培养操作基本要领和要求v防止污染是决定培养成功或失败的首要条件防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要

9、努力做到最大限度的无菌。中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片、制定出分门别类的操作卡片。v如如“分装血清分装血清”、“组织块贴壁初代培养组织块贴壁初代培养”、“传代培养传代培养”、等等。各卡片上记有需用、等等。各卡片上记有需用器材和器材和物品名称、要求及数量等，物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。作场地，然后进行消毒。2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。很好。用用30 瓦

10、紫外线管灯，操作箱消毒瓦紫外线管灯，操作箱消毒20 一一30 分钟即可；操作室空间大，需消毒分钟即可；操作室空间大，需消毒3050 分钟。分钟。v在用紫外线灯照射期间，在操作台面上在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖必要时可用纸张覆盖)。v紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果毒效果3、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时

11、，因整个前臂要伸入箱利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。内，洗刷时一定要清洗到肘部。75酒精，酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2的新洁的新洁尔灭洗涤消毒。尔灭洗涤消毒。 进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。室内工作需着消毒衣帽。二、火焰消毒：二、火焰消毒：v在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安

12、装吸管安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。v已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼！已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。有害物带入培养液中。v消毒火焰要求无色或微蓝色消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用入培养液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的的不含杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精

13、。酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。三、培养操作注意事项三、培养操作注意事项1、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。快，以防空气流动，增加污染机会。2、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。3、布局：、布局：v原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央在左侧，酒精灯置于中央(图图4-1)。工作由始至终要。工

14、作由始至终要保持一定顺序性。保持一定顺序性。4、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。不再重复使用，应立即封闭瓶口。5、培养用瓶开瓶以后，皆应保持、培养用瓶开瓶以后，皆应保持45 度斜位或平放，度斜位或平放， 吸取营养液吸取营养液bss、细胞悬液及其它各种用液时，均应、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。交叉污染。6、工作中

15、不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细、工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。菌或支原体带入工作台面发生污染。第三节第三节 基本培养操作技术基本培养操作技术一、传代培养法一、传代培养法v当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。培养。这一操作称传代或再培养。80% 汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代？为什么要进行传代？1、贴壁细胞传代、贴壁细胞传代贴

16、壁细胞贴壁细胞贴附生长型细胞贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、细胞培养常用的培养瓶、培养皿、培养皿、6孔板、孔板、96孔板孔板+ + + + + + + + + + +细胞的贴附过程细胞的贴附过程贴附物质带正电荷贴附物质带正电荷细胞带负电荷细胞带负电荷成纤维细胞：梭形、三角形、成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层可连成单层v材料和试剂材料和试剂 hela细胞细胞 rpmi1640生长液、碳酸氢钠、双抗生长液、碳酸氢钠、双抗 edta消化液（消化液（0.02%） 培养瓶、无菌吸液管（培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、

17、弯头）、弯头毛细滴管、废液缸毛细滴管、废液缸图5-6 消化法传代培养步骤v【程序【程序】(1)吸除培养瓶内旧培养液；吸除培养瓶内旧培养液；(2)向瓶内加入向瓶内加入edta 混合液少许，以能覆满瓶底为限；混合液少许，以能覆满瓶底为限；(3)置温箱中置温箱中25 分钟分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，细胞间，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；隙增大后，立即终止消化；(4)吸除消化液吸除消化液(5)用吸管吸取营养液（用吸管吸取营养液（已经加入双抗并调已经加入双抗并调好好ph值）值）加入培养瓶，轻

18、轻反复吹打瓶加入培养瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；(6)计数板计数后计数板计数后(如非实验用，不计数亦可如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。置温箱中培养。2、悬浮细胞的传代培养悬浮细胞的传代培养悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞v材料和试剂材料和试剂 hl-60细胞细胞 rpmi1640生长液、碳酸氢钠、双抗生长液、碳酸氢钠、双抗 培养瓶、无菌吸液管（培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头）、弯头毛

19、细滴管、废液缸毛细滴管、废液缸二、操作步骤二、操作步骤l、 选生长良好的选生长良好的hl-60细胞一瓶细胞一瓶 轻轻加入等量的生轻轻加入等量的生长液。长液。2 、用无菌吸液管轻轻吹打，使、用无菌吸液管轻轻吹打，使hl-60细胞均匀悬浮细胞均匀悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。3、如果细胞比较浓，可按、如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。分配传代培养。二、初代培养法二、初代培养法v意义：意义：v初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状

20、尚未发生很大最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下稳定的情况下(年龄、性别年龄、性别)，在一定程度上能反映体内状态。，在一定程度上能反映体内状态。v初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好；胞做实验，如药物测试等效果也很好；v初代培养也是建立各种细胞系初代培养也是建立各种细胞系(株株)必须经过的阶段。必须经过的阶段。1、原则：、原则：v幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组

21、织容幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养；易培养；v分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；v肿瘤组织比正常组织容易培养。肿瘤组织比正常组织容易培养。v一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。养，成功率高。（一）取材（一）取材v注意事项：注意事项：v取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成把组织切成1 立方厘米左右的小块，置于培养液中，立方厘米左右的小块，置于培养液中，4贮存；存放时间不宜超过贮存；存放时间不宜超过24 小时。小时。v

22、从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病从体内取材时，应严格保持无菌，取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500 1000 单位毫升的青、链霉素单位毫升的青、链霉素bss 液，漂洗液，漂洗5 10 分钟分钟后再做培养处理。后再做培养处理。1、鼠组、鼠组织取材织取材各种组织取材2取皮肤：取皮肤： 人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切取可利用手术时取材：请术者手术时切取l 2cm2 皮肤，即满皮肤，即满足培养要求。足培养要求。v取皮肤时可在取皮肤时可在上臂和大腿

23、内侧等上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用皮肤，用75酒精擦拭消毒酒精擦拭消毒2 3 次次(勿用碘酒勿用碘酒)。v取材方法可按如下两种方法：取材方法可按如下两种方法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2 毫米左右，向上挑起一个毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径2 3 毫米毫米小片，深度以创面微见血迹为度；小片，深度以创面微见血迹为度；二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤表面，用二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷起的皮肤表面，用手术刀轻轻

24、片取一小片表皮，大小和深度同前。手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。3取体液：取体液： v血液白细胞是常用的培养材料血液白细胞是常用的培养材料，一般多用静脉取，一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢复很快很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢复很快不易感染。从手指取不易感染。从手指取2 3 滴血即够一次培养，血滴血即够一次培养，血用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸出血后拔掉针，立即把血注入无菌等抗凝剂；吸出血后拔掉针，立即把血注入无菌

25、容器中备用。容器中备用。v取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关科室，按不同手术规程取材。科室，按不同手术规程取材。（二）组织的分离（二）组织的分离v目的：为获取多量生长良好的细胞，必须目的：为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。伤害，细胞能很好生长。v分散组织的方法分散组织的方法有离心法、机械法和化学有离心法、机械法和化学法三种；法三种；1离心分离法离心分离法v培养物为血液、羊水、腹水和胸水

26、等细胞培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。悬液时，可采用离心法分离。一般用低速一般用低速500 1000 转分速度，离心转分速度，离心5 10 分钟分钟即可。即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。胞使之受损或死亡。淋巴细胞分离法淋巴细胞分离法v原理：淋巴细胞分层液原理：淋巴细胞分层液(lyphocyte separation medium) 效果效果很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互

27、分开的。红细胞比重红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分层液适用于分离血中淋巴细胞。分层液适用于分离血中淋巴细胞。(1)取抗凝血若干毫升；取抗凝血若干毫升；(2)按按1:1 加入无菌分层液加入无菌分层液(滤过除菌滤过除菌)后，后，800 1000 转离心；转离心；(3)无菌分离出白细胞无菌分离出白细胞(白细胞位于红细胞上层，呈微白色白细胞位于红细胞上层，呈微白色)；(4)bss 漂洗漂洗1 2 次，可用于培养或其它实验。次，可用于培养或其它实验。v注意：如用动物血注意：如用动物血(如小鼠如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白，白细胞的

28、比重与人不同；小鼠白细胞比重为细胞比重为l.080 左右，需用相应比重的分层液。左右，需用相应比重的分层液。2机械分散法：机械分散法：v切割分离法：在进行组织块培养时，可采切割分离法：在进行组织块培养时，可采用剪切法，一般多剪切成用剪切法，一般多剪切成1 mm3 大小的块。大小的块。具体操作如下：具体操作如下：v无菌切取无菌切取1 cm3 组织一块，置入青霉素瓶组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪尖剪或弯剪(剪柄较长为好剪柄较长为好)伸入容器中，反伸入容器中，反复剪切组织至复剪切组织至1mm3 大小为止大小为止(成糊状成糊状)

29、。然。然后用吸管吸取后用吸管吸取hanks 液把附着在剪刀上的液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并再补加组织小块冲下，并再补加3 5 毫升毫升hanks 液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、余下组织块即可用于培速离心、去上清、余下组织块即可用于培养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。但操作比较方便。压挤法压挤法3消化分离法：消化分离法：v组织消化法是在把组织剪切成较小体积的组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后

30、成细胞团或单个细胞，组织的方法。最后成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。同，可选用特定的消化手段。1消化培养法消化培养法(单细胞培养）单细胞培养）(三三)原代细胞培养类型原代细胞培养类型(1)准备准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒面，紫外线消毒20 分钟；注意：组织块、胰分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤

31、害的物品，蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；需用纸张覆盖，以免受射线影响； (2)处理组织处理组织：把组织块置入烧杯中，用：把组织块置入烧杯中，用hanks 液漂洗液漂洗23 次，去除血污；如怀疑组织可能次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060 分钟；分钟；(3)剪切剪切：用眼科剪把组织块切成：用眼科剪把组织块切成23 毫米大毫米大小的块小的块(用手术刀切割亦可用手术刀切割亦可)，以便于消化；，以便于消化；(4)消化消

32、化：加入比组织块总量多：加入比组织块总量多3050 倍的倍的胰胰蛋白酶液蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置) 37温箱消化均可，消化中每隔温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。硬度而定。(5)分离分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞组织已分散成细胞团团或或单个细胞单个细胞，立即终止消

33、化，随即通过适宜不锈，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续必要时可继续进行消化进行消化)；低速低速(5001000 转分转分)离心消化液离心消化液5 分钟分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用如用其它酶或其它酶或edta 等消化，需用等消化，需用hanks 液洗脱一两次液洗脱一两次后，再加入培养液后，再加入培养液)；(7)计数计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；

34、对大多数细胞来说，对大多数细胞来说，ph 要求在要求在7.27.4 范围，范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用可用nahco3调整；调整；(8)培养培养：置入：置入36.5度度 温箱培养；如用温箱培养；如用co2 温箱温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口松口)堵塞，堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。2、组织块培养法、组织块培养法:v【程序【程序】(1)剪切剪切：把组织小块：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉素小瓶中，置入小烧杯或青霉素小瓶中，用用han

35、ks 液漂洗液漂洗23 次以去掉表面血污，吸净次以去掉表面血污，吸净hanks 液，用眼科剪反复剪切成液，用眼科剪反复剪切成lmm3 块为止；块为止；(2)摆布摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距离为离为0.5cm 为宜，每一为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布培养瓶底可摆布2030 块；块；(3)轻轻翻转培养瓶轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置小块流动，塞好瓶塞，置36.5温箱温箱2 小

36、时左右小时左右(勿超勿超过过4 小时小时)，使小块微干涸；，使小块微干涸；(4)培养培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，：从温箱中取出培养瓶，开塞，46 度斜度斜持培养瓶持培养瓶(瓶底仍向上瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组组织小块附着尚不牢，注意不要把组织块冲走织小块附着尚不牢，注意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。增多后，再补加培养液。

37、三、三、 细胞计数细胞计数 一、原理一、原理 细胞计数结果以细胞计数结果以细胞数细胞数/ /毫升毫升表示。细胞计数的原理和方法表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。 用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数

38、和相对活力。也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂二、仪器、用品与试剂1 1、仪器与用品：、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管普通显微镜、血球计数板、试管、吸管2 2、试剂：、试剂：0.40.4台酚兰台酚兰( (台酚兰台酚兰 0.40.4克克 加双蒸水至加双蒸水至100ml)100ml)3 3、材料：、材料：细胞悬液细胞悬液( (细胞悬液的制备：用毛吸管吸细胞悬液的制备：用毛吸管吸5 5滴细胞滴细胞悬液到一小试管中，加入悬液到一小试管中，加入1 1滴台盼蓝染液（滴台盼蓝染液（0.40.4）或苯）或苯胺黑，混匀，静置胺黑，混匀，静置2 23min,3min,活细胞不会被染

39、色，而死细活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。胞和死细胞。) )三、操作步骤三、操作步骤 1 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。在计数板上。 2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。盖片和计数板之间。 3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。 4 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧

40、和上方的。然后按下式计算：计左侧和上方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml （ 四个大格子细胞数四个大格子细胞数/4)/4)稀稀释倍数释倍数10104 4 /ml /ml说明：说明： 公式中除以公式中除以4 4因为计数了因为计数了4 4个大格的细胞数。个大格的细胞数。 公式中公式中乘以乘以2 2于染液是于染液是1 1：1 1稀释。稀释。 公式中乘以公式中乘以10104 4因为计数板因为计数板每一个大格的体积为：每一个大格的体积为： 1.0mm1.0mm（长）（长）1.0mm1.0mm（宽）（宽）0.1mm0.1mm（高）（高）0.10.1mmmm3 3 而而

41、 1ml1ml10001000mmmm3 3 。四、细胞计数要点四、细胞计数要点1.1.要求悬液中细胞数目不低于要求悬液中细胞数目不低于10104 4个个/ml/ml，如果细胞数目很，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4. 4. 数细胞的原则是只数完整的细

42、胞，若细胞聚集数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 5. 5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。液流入旁边槽中，否则要重新计数。 五五、初学者易犯的错误：、初学者易犯的错误： 1. 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 3.

43、滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁 边的槽中。边的槽中。细胞计数原理细胞计数原理四、四、 细胞冻存细胞冻存1原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，最终境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，最终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二保护剂甘油或二甲基亚矾甲基亚矾(dmso)，可使冰点降低，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的能

44、使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。发生。v当前最常用的保护剂仍为甘油和当前最常用的保护剂仍为甘油和dmso，它们对细胞无毒、，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5 15之间，常用之间，常用10。2要点要点: v为保持细胞最大存活率，为保持细胞最大存活率，v一般都采用慢冻快融的方法。一般都采用慢冻快融的方法。各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，另外用什么防护剂合适和用量多大，要胞耐受性可能大些，另外用什么防护剂合适和用量多大，

45、要依细胞而定，依细胞而定，v初代培养细胞用初代培养细胞用dmso 较好，一般细胞可用甘油；用量以较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20 30甘甘油中很好。油中很好。原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。v程序程序(1) 细胞处理细胞处理：选对数生长期细胞；收集细胞：选对数生长期细胞；收集细胞24 小小时前换液一次；时前换液一次；(2)冻存液冻存液：先用培养液：先用培养液9 分分+ d

46、mso 1 分分(或甘油或甘油)配成配成10的的dmso 冻存液；按按常规法把细胞制冻存液；按按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达成细胞悬液，计数、令细胞密度达107ml (一般一般用用4瓶细胞瓶细胞)， (4) 分装分装：分装入无菌冻存管中，每管加：分装入无菌冻存管中，每管加1.5 毫升细毫升细胞悬液；胞悬液；(5) 封口：封口：拧紧冻存管盖，仔细检查，定要封严，拧紧冻存管盖，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察；必要时可浸入蓝色液中观察；（6）入纱布小袋中入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎受热发生爆炸

47、伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，有小牌，v注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；(7) 冻存冻存：当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法：的情况下，可用手工办法：4 1h、-20 2h、85 1h、从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，、从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按按-1 -12分钟速度，在分钟速度，在30 40 分钟内，分钟内，下降到液氮面，再停下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。分钟后，直投入液氮中。v注意：注意： 操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮操作时应带保护眼镜和手套，以免液

48、氮伤人；伤人；细胞注入安瓶中后一定封严，最好使用细胞注入安瓶中后一定封严，最好使用塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。五、冷冻细胞复苏方法v程序程序(1) 从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因末从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因末封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅速气化而发生爆炸速气化而发生爆炸(力量有限力量有限)，因此应带防，因此应带防护眼镜和手套；护眼镜和手套；(2) 迅速放入盛有迅速放入盛有36 37水的搪瓷罐中，扣水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内溶解；溶解

49、；(3) 用用70酒精擦试消毒后，净化台上打开盖，酒精擦试消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加加10ml 培养液，吹打使细胞悬浮；培养液，吹打使细胞悬浮；(4) 低速离心低速离心(500 1000 转分转分) 5 分钟。分钟。(5) 去上清，加入培养液适当稀释后，再移装去上清，加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。养液后再继续培养。v注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做许做1：10 倍或倍或1：20 倍

50、的稀释倍的稀释(细胞数细胞数毫升毫升)；一般每瓶细胞接种浓度为；一般每瓶细胞接种浓度为5105m1，因此冻存密度应达到，因此冻存密度应达到107ml，在稀，在稀释释20 倍时，仍能保持倍时，仍能保持5105ml 数量。数量。六、细胞运送六、细胞运送v一是用液氮或干冰保存一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；二为充液法二为充液法：(1) 选生长状态良好的细胞，待达选生长状态良好的细胞，待达80或或90汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要汇合时

51、，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部达到培养瓶的颈部(过满易污染过满易污染)，保留少许，保留少许空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；易使细胞脱落；(2) 妥善包装和运送；一般在不超过四五天到妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；(3) 到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置置37培养，次日传代。培养，次日传代。七、收到细胞的处理方式七、收到细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻

52、管是否有解请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存或立即冷冻保存(置于置于70 c， 隔夜后，隔夜后， 移到液氮移到液氮)。 2. 冷冻细胞解冻程序冷冻细胞解冻程序: 1）依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种）依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。类和其它指定之成份和比例，制备培养基。2）fbs (fetal bovine serum, 胚牛血清胚牛血清), cs (calf serum, 小牛血清小牛血清)和和hs (horse serum, 马

53、血清马血清)，对，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。血清种类培养之。 3） 将培养基置于将培养基置于37 c 水槽中回温，轻摇水槽中回温，轻摇冷冻管使其在冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，回温后分钟内全部融化后，回温后喷以喷以70 % 酒精并擦拭之，酒精并擦拭之， 移入无菌操作台移入无菌操作台内。内。 4） 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至培养基加至t25 或或t75 flask中。取出中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入t25 或或t75 flask 内之培养基，内之培养基， 混合均匀，放入混合均匀，放入 37 ，5 % co2 培养箱培养。培养箱培养。 5）对绝大多数细胞而言，）对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂以下之冷冻保护剂dmso，不会