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文档简介
1、Company LOGO标准菌株的应用及保藏技术标准菌株的应用及保藏技术上海汉尼生物技术有限公司上海汉尼生物技术有限公司缪文俊缪文俊 市场部市场部Company Logo内容提要内容提要v前言前言v菌种保藏机构菌种保藏机构v标准菌株的应用标准菌株的应用v实验室适用菌种保藏技术实验室适用菌种保藏技术v其它保藏技术其它保藏技术Company Logo前言前言v药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株,或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。v菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术,菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。v药品微生物检验主要考虑其标准
2、性。Company Logo各国菌种保藏机构各国菌种保藏机构v中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)v美国典型菌种保藏中心(ATCC)v美国北部地区研究实验室(NRRL)v荷兰霉菌中心保藏所(CBS)v英国国家典型菌种保藏所(NCTC)v日本的大阪发酵研究所(IFO)v法国里昂巴斯德研究所(IPL)v国际微生物学联合会(IAMS)v世界菌种保藏联合会(WFGC)Company Logo标准菌株的应用标准菌株的应用v培养基适用性检查培养基适用性检查v方法验证方法验证v阳性对照试验阳性对照试验v抑菌效力检查抑菌效力检查v能力验证能力验证促生长能力检查促生长能力检查抑制能力检查抑制能力检查指示特性检
3、查指示特性检查Company Logo培养基适用性检查培养基适用性检查 意义意义:证实在规定的实验条件下,培养基能支持微生物的生长,那么检品中可能存在的微生物就能在该培养基内或者培养基表面生长,或出现混浊或形成菌落,从而防止出现假阴性保证检测结果的真实性。 菌种:不得超过5代Company Logo1 .促生长能力检查 加入一定量的标准阳性菌株菌悬液(菌的数量要求在50-100cfu)至被检培养基和对照培养基平板上,按规定温度及不长于规定的最短培养时间下培养,被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征一致。2 .抑制能力检查 接种不少于100cfu的菌悬液于被检培养基,按规定温度及不短于规定的
4、最长培养时间下培养,试验菌应不得生长。Company Logo3 .培养基指示特性检查 加入一定量的标准阳性菌株菌悬液(含菌数不大于100cfu)至被检培养基和对照培养基平板上,按规定温度及不长于规定的最短培养时间下培养,被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。Company Logo微生物检验方法验证微生物检验方法验证v 包括计数方法与控制菌检查法验证v 计数方法验证:有平板法和薄膜过滤法两种方法,验证要求对照菌回收率不得低于70%。v 控制菌检查法验证:要求阳性对照应检出控制菌,阴性对照应无菌生长。v 试验中使用的标准菌株有:大肠埃希菌,金黄色葡萄球
5、菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠菌,黑曲霉。v 菌种传代不得超过5代,菌液浓度为不大于100cfu/mlCompany Logo阳性对照试验阳性对照试验v 为便于研究观察成药制剂中,某些含有防腐剂和抑制菌成分的干扰作用,以及测试常规检验方法和培养基、试剂等的灵敏度时,可将定量的已知阳性对照菌加在供试品稀释液中,按检验供试品的操作方法进行阳性菌的对照试验,阳性对照菌应生长。 Company Logo抑菌效力检查抑菌效力检查定义:在化妆品和药品中为了增加产品的保质期一般都会加入防腐剂,因此需要进行一定的试验来验证防腐剂的防腐效力,通常采用挑战性试验来检测。 调制一定浓度的阳性菌株加入待测产品中,在一段时
6、间内间隔性的取样(第7、14、28天),检测在产品中的残余的菌落数,据此可以判断防腐剂的效力。Company Logo能力验证能力验证 能力验证是为确保实验室维持较高的核准和检测水平而对其能力进行的考核、监督和确认的一种验证活动。 个人操作技能及某些操作流程的正确性验证。 盲样:按规定操作程序进行检测,但是并不在样品上标明菌的名字而是以代号来代替。Company Logo菌种保藏的原则: 降低微生物细胞的代谢强度,使细胞基本上处于休眠 态,生长繁殖受到抑制但不至于死亡,以减低菌种的变异率。 菌种保藏的原理: 菌种保藏的具体方法很多,原理却大同小异。 首先要挑选典型菌种的优良纯种,最好采用它们的
7、休眠体(如分生孢子、芽孢等); 其次,还要创造一个适合其长期休眠的环境条件,诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。 菌种保藏菌种保藏Company Logov 美国药典(USP)中规定:“将微生物接种至一新鲜培养基上/内,每萌发一次即称为一代,因此,当原始菌种复溶并转至一培养基内生长,即认为已传代一次,”并规定“菌种的传代次数(自原始菌种冻干粉起)不得超过5代”。v 我国的GMP认证中也如此要求,并且中国药典2010年版药典也已做出“菌种的传代次数不得超过5代” 这个明确的规定。 Company Logo实验室适用的微生物保藏技术实验室适用的微生物保藏技术v琼脂斜面
8、低温保藏法v液体石蜡覆盖保存法v低温冷冻保藏法v甘油冷冻保藏法v磁珠保存法v冻干保藏法Company Logo1.1.琼脂斜面低温保藏法琼脂斜面低温保藏法v 适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏v 优点:简便、大多数微生物适用v 缺点:保藏期短;传代次数多;容易发生菌体自溶及基因突变。v 生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤(琼脂)培养基Company Logov 细菌置46保藏,芽孢杆菌每36个月移植一次,其他细菌每月移植一次。 v 放线菌于46保藏,每3个月移植一次。 v 酵母菌于46保藏,每46个月移植一次。 v 丝状真菌于46保藏,每4个月移植一次。 v 担子菌
9、于46保藏,每3个月移植一次。v 保藏的湿度通常在5070为宜。Company Logo2.2.液体石蜡覆盖保存法液体石蜡覆盖保存法v 在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡,主要适用于霉菌,酵母菌,放线菌,需氧性细菌等的保存 。v 优点:防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡, 阻止氧气进入,以减弱代谢作用。v 其具有方法简便的优点,同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存,而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。Company Logo3.3.低温冷冻保藏法低温冷冻保藏法
10、v 可分低温冰箱(-20-30,-50-80)、干冰酒精快速冻结(约-70)和液氮(-196)等保藏法。v (1)低温冰箱保存法:多数微生物在-20度保存效果良好v (2)干冰保存法:-70度保存v (3)液氮保存法:保存温度克达到-196度,本法可说是使用范围最广的微生物保存法. Company Logo4.4.甘油冷冻保藏法甘油冷冻保藏法v 将保藏菌种接种琼脂斜面上,适宜温度下培养适宜时间,用无菌接种环轻轻刮取菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使菌种充分扩散到无菌水中,调证菌液浓度,向已制备好的菌悬液加入等体积的20无菌甘油,轻轻振试管管,使内容物充分混合,分装于无菌小管。甘油冷冻管
11、最好在-30 贮存。Company Logo5.5.磁珠保存法磁珠保存法v 将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水caso4),上铺玻璃棉,再放上1020粒磁珠,经干热灭菌后,接入菌悬液,最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效,特别适用于根瘤菌,可保存长达两年半时间。Company Logov 成品化菌株保藏管,内含特制20-25颗玻璃珠,只需将培养好的菌株接入溶液中,摇匀成菌悬液,细胞即吸附于小珠上,然后吸出溶液,将保藏管置-70可保存5年,置-20可保存1-3年。v该方法适用于细菌,霉菌和酵母等,特别适合
12、保存苛养和该方法适用于细菌,霉菌和酵母等,特别适合保存苛养和娇弱的菌株。娇弱的菌株。Company Logo6.6.冻干保藏法冻干保藏法v 真空冷冻干燥 (vacuum freeze-drying):将微生物冷冻,在真空减压下利用升华作用除去水分,使细胞的生理活动趋于停止,从而长期维持存活状态。v 冷冻干燥法适用范围:适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的保藏,但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。v 是一种长期保藏菌种,一般情况下购买的冻干菌种即为此种方法,使用时需要溶解、复壮和冷藏。Company Logo其他菌种保藏技术其他菌种保藏技术v载体保存法载体保存法
13、 土壤保存法土壤保存法 砂土保存法砂土保存法 硅胶保存法硅胶保存法 麸皮保存法麸皮保存法 滤纸片保存法滤纸片保存法v悬液保存法悬液保存法v寄主保存法寄主保存法v牛乳保存法牛乳保存法Company Logo保存菌种的保存期限保存菌种的保存期限菌种菌种培养时培养时间(间(h)培养基培养基保存温保存温度(度()保存时间保存时间流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌1824脱纤维羊血或脱脂牛奶脱纤维羊血或脱脂牛奶-206个月个月葡萄球菌、葡萄球菌、链球菌链球菌1824血琼脂斜面(高层加液体石蜡)血琼脂斜面(高层加液体石蜡)4813个月个月肠杆菌科肠杆菌科1824Soxbean酪蛋白琼脂高(加液体石酪蛋白琼脂高(加液体石蜡)蜡)481年年肠杆菌科、肠杆菌科、非发酵菌、非发酵菌、
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