呼吸道感染IgM九项联检试剂说明书终稿(DOC)

1、1 呼吸道感染 IgM 九项联检试剂盒（间接免疫荧光法） 说明书 【产品名称】 通用名称：呼吸道感染 IgM 九项联检试剂盒（间接免疫荧光法） 英文名称： PNEUMOSLIDE IgM 商品名称： PNEUMOSLIDE IgM 【包装规格】 10 人份/ 盒 【预期用途】 采用间接免疫荧光法（ IFA ），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的 IgM 抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清 1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎 衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒 1 、 2 和 3 型。 已报道的非典型性肺炎的病原体有很多，其中最常见的有： 嗜肺军团菌

2、 人最易感染的是嗜肺军团菌血清 1 型，非典型性肺炎常伴随有全身症状。 10%的 肺炎是由嗜肺军团菌血清 1 型引起的。在血清学诊断中， 间接免疫荧光法 （IFA ）是 唯一的标准技术。 肺炎支原体 肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见， 由于很难将其固定在载玻片 上，因此先将肺炎支原体抗原固定在细胞中。 Q 热立克次体 Q 热是由 Q 热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或 心内膜炎。血清学诊断中， IFA 检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。 肺炎衣原体 肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。在老年人中发病 率较高，它所引起的肺炎占所有肺炎

3、病例的 10%。微量免疫荧光法（MIF）是最灵敏 和最特异的诊断方法。 腺病毒 腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和 轻度呼吸道感染。 呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒（RSV）是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发 流行。 流感病毒 它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。由于它 易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。因此，实验室诊断就 显得非常重要。 副流感病毒 副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎 （哮吼）。3型具 有流行性，12 和2型具有地域性。 【检测原理】 间接免疫荧光法（IFA）

4、是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生 的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤 步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用 免疫荧光显微镜观察结果。 可兄光 【主要组成成份】 除PBS外，所有试剂均可直接使用。为了易于识别，所有试剂均有一个给定的 编号。在操作骤中，写明了每一步所使用试剂的编号。 1 载玻片：10片（10孔/片），含有下列抗原： 1. 嗜肺军团菌血清1型（悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细 菌聚集） 2. McCoy细胞中的肺炎支原体 3. Q热立克次体II期（悬浮于0.5%正常鸡卵黄

5、囊中以增强抗原吸附性和避免细菌 聚集） 4. 肺炎衣原体（原生小体） 5. HEp-2细胞中的腺病毒 6. HEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒 7. LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒 8. LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒 9. LLC-MK2细胞中副流感病毒1、2和3型 10. 质控孔。 除了嗜肺军团菌，载玻片中的所有抗原都是从细胞培养物中获得。 每一个病毒孔 里都含有1%15%用甲醛灭活的感染细胞，无感染的细胞用丙酮固定。 3 2 PBS: 1瓶，pH 7.2PBS粉末，用1L蒸馏水溶解。 3阳性质控：500 L阳性质控血清，含叠氮钠。 4阴性质控：500 L阴性质控血清，含叠氮钠。 5

6、M FITC标记的抗人IgM结合物：2 x 1.1mL，荧光素标记的抗人IgM磷酸缓冲液, 含有伊文斯蓝、叠氮钠和蛋白稳定剂。 6封闭介质：3mL，甘油缓冲液，含叠氮钠。 7抗人IgG球蛋白（吸附剂）：1 x 1.5mL （羊抗人IgG，含叠氮钠）。 需要但未提供的材料： 1. 精确的微量移液器 2. 恒温培养箱 3. 蒸馏水 4. 24x60 mm盖玻片 5. 湿盒 6. 荧光显微镜以及制造商推荐的滤光片 【储存要求及有效期】 28C储存。不要使用超出标签上有效期的试剂。未拆封的试剂盒 28C储存可 稳定至标示有效期的月末。 拆封后试剂的储存 试剂 稳定性和储存 溶解后的 PBS 2-8OC

7、 4 个月，在有效期内使用 其它组分 参照包装标签的有效期（2-8OC 储存） 试剂的稳定性及操作 在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。仅使用试验所需量的吸附剂、 PBS、质 控血清和结合物溶液，剩余的试剂不要倒回瓶中。PBS溶解后储存在28 0C,如出现 浑浊请勿使用。 对于试剂盒内试剂的不正确操作， VIRCELL, S.L.将不对其试验结果负责。 W33 4 【适用仪器】 荧光显微镜 【注意事项】 1. 仅用于体外诊断。仅限专业人员使用。 2. 仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。只有 PBS、 吸附剂、封闭介质和载玻片可与其他批次 VIRCELL IFA试剂盒

8、通用，其它组分同批 次可以混用。 3. 每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。 4. 包装如有损坏请勿使用。 5. 切勿用嘴吸移液管加样。 6. 本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人 源性物质。尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为 HBsAg、HCV抗体和HIV抗 体阴性，质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。 孔内包被的经灭活 的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道 合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2和3型，也仍应视为具 有潜在感染性并小心处置。目前没有方法

9、可以确保这些或其他感染性物质不存在， 因 此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置， 应遵守当地关于临床废弃物处理的法 规。 7. 结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度v 0.1%）,避免接触酸和 重金属。 8. 封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在咼温下。 9. 伊文斯蓝（浓度v 0.1%）是一种致癌物。请勿接触皮肤和眼睛。万一接触到该溶 液，用水彻底冲洗并到医院检查。 10. 仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。 11. 载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。 12. 显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。 13. 不

10、要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。 14. 每个载玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用没有用过的孔。 15. 试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。 5 16. 吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。 【样本要求】 需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整 性。血清样本采集后28 0C冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-200C）保存。不要 反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是 IgM。不要使用高血脂或污染的血清。 若样本中含有微粒要离心使之澄清。 【检测方法】 *实验前准备 只有PBS需要预先配制。将试剂2中的成分加入1L蒸馏水中，

11、摇匀直止完全 溶解。配好后储存在2-8cC。 *实验步骤 1. 使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。 2. 按1:1比例稀释血清标本，即25让血清加入25丄PBS2中。质控血清 4不需 要稀释。 3. 用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：将30此稀释后的血清加入150此吸附 剂中，彻底混匀。质控血清 3和4不需吸附剂处理。处理后的血清要离心除去沉淀， 以防干扰检测。 4. 在载玻片1的每孔中加15此吸附剂处理过的血清。在一个载玻片的每孔中加入 15此不稀释的阳性质控3,在另一个载玻片的每孔中加入15丄不稀释的阴性质控#。 5. 将载玻片放入湿盒中，37C温育90分钟。 6

12、. 用PBS 2的缓慢水流简单冲洗载玻片（避免PBS直接冲入孔内）后，浸泡在PBS 中并放置在振荡器上轻轻摇动10分钟。将载玻片在蒸馏水中简单蘸洗。 7. 载玻片1自然风干。 8. 每孔加入15让抗人IgM FITC结合物溶液5M （不需稀释）。 9. 将载玻片放入湿盒，37 T温育30分钟。 10. 重复6和7的洗涤步骤。 11. 每孔加1小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。 12. 尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察， 可将其避光 放置于2-8OC不超过24小时。 6 【内部质量控制】 每一批产品在放行前都要经过更加严格的内部质量控制（ Q.C.）的检验。质控材 料可

13、溯源到经过内部确认的参考血清盘。 【有效性判断】 每一次试验都应设立阳性和阴性质控，以确认试验和试剂盒的有效性。 观察到的荧光模式应为： 阳性质控：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的 1-15% 细胞出现苹果绿细胞核和胞浆或胞膜荧光 （在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时 观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光； 支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。 阴性质控：军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光，支原体、腺病毒、甲型和 乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。 检测结果的解释】 阳性结果： 可以观察到腺病毒、 流

14、感病毒、 呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性 血清的 1-15%细胞的细胞核和胞浆出现苹果绿色荧光 (在副流感病毒和呼吸道合胞病 毒中能同时观察到着色的合胞) ；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹 果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。 阴性结果：可观察到军团菌、 肺炎衣原体和立克次体没有荧光， 支原体、腺病毒、 甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。 如果所有细胞或第 10 孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体，不能判为阳性， 应用其他方法进行检测。当质控孔中无荧光时一定要查明原因。 由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，阳性结果需结合临床

15、症状综合 评价。建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。 呼吸道感染IgG联检试剂(PNEUMOSLIDE IgG )更适合于筛查试验。对于广泛 流行的疾病，可能会在一个标本中出现几个阳性结果。呼吸道感染 IgM 联检试剂 (PNEUMOSLIDE IgM )由于其高度特异性，是一种非常适用的技术，因为 IgM 阳 性不会超过 3 个月，但对重复感染灵敏度较低。近期感染诊断的理想方法是同时使 用呼吸道感染IgG联检试剂和呼吸道感染IgM联检试剂：IgM联检试剂适用于检测 成人的第一个标本和儿童的第一、 第二个标本， IgG 联检试剂适用于检测成人的第二 个标本。 7 与说明书中所列结果不同不能

16、判为阳性。 在初次感染和再次感染的过程中， IgG 和 IgM 抗体有不同的表现方式： 初次感染 时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现(IgM早于IgG出现)； 而再次感染时， 在所有的情况下均不出现IgM，因此IgG的检测是唯一有用的诊断方法。在许多疾 病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM 一般情况下仅在感染后23个月 存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。 【检验方法的局限性】 1. 本试剂盒用于检测人血清。 2. 建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结 果。特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、 温育的时间控制对获得准确结果

17、都是很重要的。 3. 样本的检测结果应与临床评价以及其他诊断方法结合使用。 4. 本检测不能指出感染部位，不能单独使用。 5. 抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性。 6. 在感染早期采集的样本可能是检测不到IgG的，在这种情况下建议采用IgM检测, 或者在14-21天后采集第二个血清样本，并与原标本同时检测来确定是否发生血清转 换。 7. 婴儿的IgG检测结果要作谨慎解释，因为出生前母体的IgG被动的传递给了胎儿。 对6个月以下的婴儿IgM检测是更为有用感染标志物。 8. 单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集成对样本（急性期 和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的

18、明显升高。 9. 对患有自身免疫性疾病病人的血清， 用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、 呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用本方 法评价。质控孔用于检测这种现象。在嗜肺军团菌和 Q热立克次体中，有时血清会 含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。 当出现这 种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了。 10. 未对本检测在疗效随访方面的性能做过评估。 11. 除了肺炎外，未对本技术在肺炎衣原体引起的其他疾病方面的性能作过评估。 【产品性能指标】 1.灵敏度和特异性 嗜肺军团菌血清1型 与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测82份血

19、清样本，结果如下： 8 样本数 灵敏度 特异性 IgM 82 94.4% 98.4% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 肺炎支原体 与一种ELISA试剂盒对照检测62份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 igM 62 96.8% 100.0% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 Q热立克次体 与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 74 100.0% 97.6% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 肺炎衣原体 与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测61份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 61

20、 100.0% 98. 0% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 腺病毒 与一种ELISA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 74 85.7% 97.0% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 呼吸道合胞病毒 9 与一种ELISA试剂盒对照检测97份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 97 93.8% 100.0% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 甲型流感病毒 与一种ELISA试剂盒对照检测46份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 igM 46 94.1% 96.4% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。

21、 乙型流感病毒 与一种ELISA试剂盒对照检测40份血清样本，结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 40 100.0% 96.4% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 副流感病毒1、2和3型 与一种ELISA试剂盒对照检测36份血清样本。结果如下: 样本数 灵敏度 特异性 IgM 36 100.0% 96.3% 有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 2. 精密度 分析内精密度： 在相同实验条件下由同一个操作人员在同一次试验中对 3份血清（2份阳性和1 份阴性）分别进行5组加样检测。 结果：滴度变化不超过一个稀释度。 10 分析间精密度： 在5种不同条件下（不同操作人员或不同试验

22、日期）对 3份血清（2份阳性和1 份阴性）进行检测。 结果：滴度变化不超过一个稀释度。 3. 交叉反应和干扰 嗜肺军团菌血清1型 检测 20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和 Q 热立克次体）、革兰 氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌）和抗核抗体阳性血清样本。 肺炎支原体 检测 12份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、肺炎衣原体和 Q 热立克次体）阳性血 清样本。 Q 热立克次体 检测 20 份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌）、同种属 的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。 肺炎衣原体 检测 20份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、 Q 热立克次体和肺炎支原体），同种

23、 属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。 腺病毒 检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）阳性血清 样本。 呼吸道合胞病毒 检测 10份病毒综合病症组（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根 据病毒分类（麻疹）阳性血清样本。 甲型流感病毒 检测8份病毒综合病症组（RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性的 血清样本。 乙型流感病毒 检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性血 清样本。 副流感病毒血清 1、 2和 3 型 检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒）阳性血清样本。 结论 检测结果表明

24、本试剂盒与上述参考品无交叉反应或干扰， 从而证实了该试剂盒的 特异性反应。 其它干扰研究 11 对25份类风湿因子阳性血清进行了 2种病毒和2种细菌抗原IgG和IgM抗体 的检测。对另外两份血清进行了每种抗原 IgG和IgM抗体的检测。在IgM检测中， 用抗IgG抗体对血清进行了吸附处理。结果显示，吸附剂可以有效避免类风湿因子的 干扰。 经验证，吸附剂也可以有效地避免IgG抗体过量造成的假阴性。 【标签符号】 Rvol 体外诊断用医疗器械 FI 2 使用有效期 8cC 储存条件2-8CC 2cC扌 V 可用于检测的次数（规格） 阿 批号 目录号 a 使用说明书 WCLLJ 每个载玻片上反应孔的

25、数量 12 【简明操作程序】 在载玻片的孔里分别加入稀释的血清和质控品凤 握盒 I 37 C90 分钟 PBS 洗两次蒸憾水洗一次$ J 自紐干 加入荧光素结合物颐 握盒 37 C30 分钟 用 PBS 洗两次蒸惚水洗一次 0 J 自然风干 加入一小滴封闭介质目 盖上盖玻片 _ * _ 在荧光显微镜 400 倍视野下观察 【参考文献】 1. Berdal, B. P.; Fields, P. I., and Melbye, H. Chlamydia pneumoniae respiratory tract infection: the interpretation of high titres

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