基因工程三PPT课件

1、基因工程（三）九、目的基因的高效表达（一）、基因表达的基础知识（一）、基因表达的基础知识（二）、原核生物基因表达的基本特点（二）、原核生物基因表达的基本特点（三）、提高目的基因高效表达的途径（三）、提高目的基因高效表达的途径 （四）、目的基因高效表达规律（四）、目的基因高效表达规律（一）、基因表达的基础知识（一）、基因表达的基础知识1 概念： 1-1 以mRNA为模板的蛋白质合成过程称为翻译或转译1-2 mRNA： 从DNA到蛋白质的信息传递载体1-3 遗传密码： 3个碱基编码一个氨基酸，这三个碱基被称为三联体密码或密码子2 核糖体：合成蛋白质的“工厂”核糖体由两个亚基构成，一个较大，一个较小

2、原核生物原核生物核糖体30S亚基50S亚基21种蛋白质16SrRNA34种蛋白5SrRNA23SRNA真核生物核糖体40S亚基60S亚基30多种蛋白质18SrRNA50多种种蛋白5SrRNA28SRNA3.蛋白质的合成机理（以原核生物为例）肽链延伸的方向：N末端C末端mRNA的翻译方向：53方向tRNA识别密码子，并转运氨基酸合成的起始：大肠杆菌中被翻译的第一个密码子往往是5端的第25个核苷酸以后，起始密码子：AUG，偶有GUG，在上游约10个bp的地方往往有一段富含嘌呤的序列（SD序列），它与16SrRNA3端互补。合成的步骤：新进入的酰胺-tRNA结合到核糖体上肽链的形成移位合成的终止：识

3、别终止信号： UAG，UAA，UGA4-1 信号肽：在真核生物中，当某一种多肽的N末端刚开始合成不久，这种多肽的取向就被决定，这是因为受这个N末端的信号肽的控制。 在细菌中，也存在类似情况，新生肽的N末端也有一段信号肽结构，有时也叫引导肽4 多肽合成后的定向加工与转译后加工4-2 多肽的修饰： N末端信号肽的切除 二硫键的形成 线性多肽呈现出一定空间结构 多肽链的糖基化等 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的（二）、原核生物基因表达的特点（二）、

4、原核生物基因表达的特点 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。（三）、提高目的基因高效表达的途径（三）、提高目的基因高效表达的途径一个含有目的基因的受体细菌能否高效表达，将一个含有目的基因的受体细菌能否高效表达，将取决于基因的结构特征、宿主菌、载体构建取决于基因的结构特征、宿主菌、载体构建和细胞培养等多个方面。对于原核生物的细和细胞培养等多个方面。

5、对于原核生物的细菌等受体来说，提高目的基因表达效率主要菌等受体来说，提高目的基因表达效率主要从以下几个方面考虑：从以下几个方面考虑：1.目的基因转录和翻译方面目的基因转录和翻译方面2.目的产物本身目的产物本身3.宿主菌改造方面宿主菌改造方面4.宿主菌培养方面宿主菌培养方面1、目的基因转录和翻译方面、目的基因转录和翻译方面1-1启动子对表达效率的影响启动子对表达效率的影响 影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。 启动子是宿主细胞的RNA聚合酶转移结合并起始转录的合成mRNA的部位。大多数外源的特别是真核细胞的启动子不能被细菌（大肠杆菌）RNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子

6、控制下。 启动子的强弱必须适合，太强不利于宿主菌的正常生长代谢，太弱则目的基因转录太少，不利于目的产物的表达。 1-2 转译起始序列对翻译水平的影响转译起始序列对翻译水平的影响 翻译水平的影响外源基因的表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行，SD序列对翻译是必须，而且它也能影响到翻译的效率。 1-3 充分考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子。2 目的产物方面目的产物方面2-1 目的基因不溶性的高效表达过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不

7、溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。举例：胰岛素与-半乳糖苷酶形成包涵体优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物2-2目的基因的高效可溶性表达 概念：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。 这种蛋白质或者能够抵抗蛋白酶的水解，或者是在蛋白酶缺失的条件下生成。 优点： 无需经过融合蛋白阶段，表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。 缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。 适合：需要蛋白酶缺陷菌作为宿主菌或这改变启动子强度、或者改变宿主菌的培养条件。 举例：大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次

8、黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆菌蛋白酶合成受阻，从而使目的基因的表达产物得到保护 2-3目的基因的高效分泌表达概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外优点： 防止宿主菌对表达产物的降解；有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象减轻宿主细胞代谢负荷有利于分离需要在质粒设计时加入一段信号肽基因3 宿主菌改造宿主菌改造3-1 改造受体菌的遗传性减少或消除乙酸的生产。乙酸的大量累计会严重抑制菌体生长和目的基因的表达。遗传工程改造途径如图减少酶1活性，减少病痛酸的合成减少酶7活性，减少乙酸的形成克隆酶3基因，使反映向乙偶姻的方向合成3-2 遗传

9、改造工程菌的输氧能力，不再使贫氧成为工程菌限制因子。因为，在一般情况下，溶解氧是菌体生长的限制因子。4 .宿主菌培养方面宿主菌培养方面 影响重组菌表达效率的的生理代谢和培养条件 重组菌的质粒丢失倾向 重组菌的能量分流现象 目的蛋白往往是异源蛋白质，会宿主菌有危害 细胞培养过程中，会产生乙酸等抑制性有机酸41提高工程菌的质粒稳定性1）在质粒构建时，比如加入抗性基因，在培养中就加入抗生素，就会抑制不含质粒的细胞比例创造了条件2）在工程菌培养过程中： 适当降低菌体的生长速率 细胞生长期和诱导表达分段培养策略42重组体的高密度培养（1）宿主菌和培养基 选择合适的宿主均。因为不同的宿主菌或同一宿主菌的不

10、同种或亚种不仅对外源蛋白的表达有很大影响，而且还影响相应的重组菌的高密度培养 培养基的成分也影响到重组宿主菌的高密度培养。比如大肠杆菌的高密度培养，常采用半合成培养基，培养基的各组分的浓度和比例要恰当。（2）流加（补料）发酵实现高密度重组菌培养（3）减少乙酸等抑制性副产物的形成大肠杆菌、枯草杆菌和哺乳动物细胞培养时分别会产生乙酸、丙酸及乳酸等移植性产物危害：影响细胞生长，抑制产物表达改进措施（以大肠杆菌为例）： 降低比生长速率 降低培养温度 限制性的加葡萄糖 基因工程菌培养和乙酸分离耦合过程 （四）、（四）、目的基因高效表达规律目的基因高效表达规律1.目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达

11、方式2.对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的表达方式3.能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型表达方式4.降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的基因在宿主细胞内长时间超持和表达5.通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞，提高细胞密度6.在宿主细胞选择、质粒构建、培养基设计都应该考虑有利于产物的分离提纯十、基因工程的应用（一）基因工程制药1、概述：利用基因工程技术研制和生产的药物 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就就是用于生物治疗的新型生物药物的研制第一个基因重组产品，也是第一个基因工程药物人胰岛素于1982年在美国

12、问世我国第一个基因工程药物干扰素-1b 于1989年上市2、基因工程药物 激素和多肽类：缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病，如人胰岛素、人生长激素、降钙素和细胞生长调节因子 酶类：利用催化反应，达到治疗目的，如tPA, 尿激酶和链激酶等 重组疫苗：防止病毒引起的人和动物传染性疾病疫苗。 单克隆抗体：既可用于疾病诊断，也可用于治疗。3 举例：糖尿病、胰岛素与基因工程 关于糖尿病：糖尿病是一种常见的内分泌疾病, 是因胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起以糖代谢紊乱为主, 继发脂肪、蛋白质、水、电解质代谢障碍。可分为胰岛素依赖型糖尿病(又称 型) 和非胰岛素依赖型糖尿病(又称型)胰岛素的结

13、构和作用结构结构：胰岛素，有AB两条肽链组成，它们中间通过3个二硫键结合起来，其中A链21个氨基酸，B链30个氨基酸。功能功能：胰岛素最显著的生理功能是：一方面提高组织摄取葡萄糖的能力；另一方面抑制肝糖元分解，并促进肝糖元及肌糖元的合成。在生物体内，胰岛素是在细胞内质网的核糖体上合成的，其合成过程是：前胰岛素原 胰岛素原 胰岛素胰岛素原，它可以看成是有一条连接肽（简称C肽）的一端通过两个碱性氨基酸（第62、63位）与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过与另外两个碱性氨基酸残基（第31、32位）与B链C末端相连。不同种属动物的C肽不同，例如人的31肽，猪的29，牛的26。胰岛素原保证了胰岛素折叠卷

14、曲，保证了三个位置正确的二硫键的形成。前胰岛素原，它比胰岛素原的末端上多一段肽链，即信号肽，含20个氨基左右，其中多是疏水侧链残基。生成过程：前胰岛素原在信号肽的引导下进入内质网腔。待肽链进入腔后，立即被信号肽酶切去“前”顺序。形成的胰岛素原后，又被运输到高尔基体然后贮存在贮存颗粒中，并在特异肽酶的作用下转变为活性胰岛素，肽酶催化胰岛素原的二个特定肽键的断裂，释放出一段中间的肽链，这个端肽链又在肽酶的作用下从链的两端各除去2个氨基酸残基而生长C肽。 关于胰岛素在体内的合成胰岛素的化学合成u1965年我国科学工作者完成了牛胰岛素的全合成。他们合成牛胰岛素的主要途径是先分别合成A链21肽和B链30

15、肽，再将A、B两条肽链经还原、氧化连接成牛胰岛素、u美国的Merrifield等人报导，他们利用固相多肽合成的方法，合成了胰岛素的A链和B两条链，A链全部用了8天时间，B链用了11天时间。获得基因途径1：Itakura等人提出的，通过化学合成胰岛素基因再重组表达，即先几十个DNA片段，然后连接起来分别得到A链和B链基因，然后把这两个基因分别表达，再组合成人胰岛素。但这个方法，二硫键正确配比率比较低，后来有人就合成简化的C肽基因，再连接A、B链构成胰岛素原基因。基因工程生产胰岛素获得目的基因途径2：将前胰岛素原的mRNA反转录成cDNA。在大肠杆菌中表达途径：在大肠杆菌中表达途径2：在酵母中表达

16、基因治疗糖尿病基因治疗：是指在基因水平上将正常有功能的基因或其他基因通过基因转移的方式将目的基因导入靶细胞并使之有效表达相应的产物,从而达到治疗某种疾病的目的。转移基因的靶细胞根据转移基因的靶细胞不同分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种途径。生殖细胞基因治疗是，将目的基因直接转入受精卵内。因转基因在受体细胞的随机整合性和可传代性, 以及其对人类长期影响不能完全预知, 并还涉及伦理学的问题, 因此目前尚不考虑生殖细胞基因治疗途径。体细胞胰岛素基因转移可分为体外和体内两种。前者是先从体内取出部分靶细胞, 经体外培养, 基因转入, 筛选出目的基因所表达的细胞, 再植回体内; 后者则是经静脉或门静

17、脉系统, 直接将有转染能力的重组基因颗粒转入活体内的靶细胞, 这些研究表明体细胞胰岛素基因转移治疗糖尿病是有希望的。 目的基因的转入方式有理化方法和生物介导转染法, 而后者占目前已运用的80% , 其中逆转录病毒系统较为成熟, 应用广泛, 在基因治疗中起主导作用。作为基因载体的病毒, 必须首先进行改建, 使其能携带目的基因, 并能定向与特异靶细胞结合, 将目的基因整合到靶细胞的染色体并产生表达。逆转录病毒作为基因转移的载体具有可转染的靶细胞种类多、转染效率高、目的基因可精确地整合到靶细胞的基因组中等优点。目的基因的导入但是, 逆转录病毒介导的基因转移技术也存在着弊端, 即携带基因不能长于8kb

18、, 仅能转染分裂繁殖的靶细胞, 最引起人们重视的是其安全性问题3: (1) 逆转录病毒基因随机插入可能引致抑癌基因失活或原癌基因的激活, 但可能性极小。(2) 逆转录病毒系统可能发生同源重组, 从而产生有复制能力的逆转录病毒, 诱发其他疾病。因此, 科学家们正致力于构建新的逆转录病毒载体4, 使其更具安全性。选择型糖尿病体细胞基因治疗的靶细胞时应考虑到: 有利于胰岛素基因表达和具有加工胰岛素原为成熟胰岛素能力的组织特异性表达细胞。目前 型糖尿病基因治疗仅停留在动物实验水平, 用于糖尿病鼠基因治疗研究的主要有三类靶细胞: 一类为胸苷激酶缺乏(Ltk2) 的鼠成纤维细胞; 一类来自鼠垂体前叶的AC

19、TH 瘤细胞(A tT 220); 第三类为鼠肝细胞。而肝细胞具有细胞类似的一些组织细胞特点, 除参与葡萄糖代谢和蛋白质合成外, 还表达细胞分泌胰岛素所需的特异性葡萄糖转运蛋白(GLU T 2 ) 和葡萄糖激酶(GK)。其特殊的解剖部位和血液循环特点, 使静脉或腹腔途径移植转导的细胞较易进入肝、脾等内脏, 而且可以通过这两条途径直接进行基因转移, 因此肝细胞是糖尿病基因治疗非常有前途的靶细胞。靶细胞选择 目前, 目的基因的导入体内并在靶细胞中表达看来并不十分困难, 但是要使其表达调控达到生理或预想的治疗水平则并不容易。 型糖尿病基因治疗中, 胰岛素的合成和分泌需要有精确的调控。分泌水平过高则造成低血糖死亡, 分泌水平过低又不能满足治疗要求。胰岛素的基因表达是一个十分复杂的问题, 也是基因治疗的一个关键问题。困难（二）基因组工程1 概念基因组：是表示某物种单倍体的总基因组：是表示某物种单倍体的总DNA，对于二倍体高等生物其配子的对于二倍体高等生物其配子的DNA总和总和即为一组基因组即为一组基因组基因组工程：以基因组为基础对物种进行基因组工程：以基因