食品微生物学实验指导手册

1、食品微生物学实验指导手册1目 录实验一 环境中微生物的检测1实验二 细菌的革兰氏染色3实验三 细菌的芽孢染色5实验四 霉菌水浸标本片的制备与观察7实验五 牛奶中菌落总数的测定技术8实验六 食品中金黄色葡萄球菌的测定11实验七 国标法测定食品中的大肠菌群14附录1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表16实验一 环境中微生物的检测一、实验目的1学习环境中微生物的检测方法。2比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。二、实验原理自然环境中普遍存在着各种各样的微生物，检测微生物的存在，简单的方法是应用一般营养琼脂，使微生物细胞或其孢子落到营养琼脂表面，在适宜温度下即可大量繁殖，形成肉眼可见的群体菌落

2、。不同微生物各自具有不同的菌落形态。三、实验仪器与材料1培养基：营养琼脂平板（NA）： 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。制法：将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121，15min高压灭菌备用。马铃薯葡萄糖琼脂平板（PDA）：成分：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000mL。制法：pH值自然。将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000mL蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000mL，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121灭菌20min。另外，用少量乙醇

3、溶解0.1g氯霉素，加入1000mL培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。 2仪器用具：恒温培养箱、记号笔四、实验步骤1、取营养琼脂、PDA平板各一个，在皿盖上用记号笔标明班级、姓名及编号。2、分别打开皿盖，做如下处理：（1）置实验台上，于空气中暴露5分钟。（2）置地面上，脚击地板，于振动的空气中暴露5分钟。（3）用自己的手指分别触摸平板（轻按即可）。（4）呼出气体于平板上。3、把经以上处理的平板分别盖上皿盖，将培养皿倒置于恒温培养箱内培养，营养琼脂平板置于37培养箱中培养48h，PDA平板置于28培养箱中培养2-3天后检查结果。五、思考题观察平板上有无微生物群体菌落出现，并

4、比较不同微生物种类所形成的菌落在形态上的差别。若PDA平板出现菌落较少或尚未长出时，置28恒温下继续培养2天观察。（1）观察NA、PDA平板上微生物的颜色、透明度、光泽度、形态、凸起。（2）比较NA、PDA平板上微生物的种类、数量。（3）分别计算不同平板及不同处理下各平板上出现的菌落数。实验二 细菌的革兰氏染色一、实验目的1. 学习并初步掌握革兰氏染色法。2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。由于革兰氏阳性菌细胞壁含肽聚糖多、脂类少，且是紧密的立体网状结构，用乙醇洗脱不出染料，故为蓝紫色；革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖少、脂

5、类多，且呈疏松的片层结构，乙醇使脂类溶解将染料洗脱，因此可被复染而呈现红色。三、实验仪器与材料1. 菌种: 牛肉膏蛋白胨琼脂培养1820h的枯草芽孢杆菌、牛肉膏蛋白胨琼脂培养24 h的大肠埃希氏菌2. 试剂: 草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液草酸铵结晶紫染色液：将2.5g结晶紫研细后，加入25mL 95%酒精使之溶解，配成A液，将1.0g草酸铵溶于100mL蒸馏水配成B液，两液混合即成。路哥氏碘液：碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL。先将碘化钾溶解在一小部分的蒸馏水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的蒸馏水即成。番红染色液：番红2.0g，蒸馏水100

6、.0mL。用蒸馏水溶解即成2%番红染色液。3. 仪器或其它用具: 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、吸水纸、生理盐水等。四、实验步骤1、涂片：取一块干净的载玻片，并在其中央滴一小滴生理盐水。接种环在酒精灯上杀菌后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后并涂布成一均匀的薄层。涂布面一般以直径1cm大小范围为宜。2、干燥：自然晾干或在火焰上烘干。3、固定：置于酒精灯火焰上加热固定（迅速通过火焰三次）。4、染色初染：将结晶紫滴于涂片上染色1min，用蒸馏水冲洗。 媒染：滴加路哥氏碘液，媒染1min，用蒸馏水冲洗。脱色：用95%乙醇边滴边洗25s，或在涂片处加12滴9

7、5%酒精浸泡25s后，立即用水冲洗。复染：用12滴番红复染2min，用蒸馏水冲洗。5、干燥：用吸水纸将多余的水分吸干。6、镜检：先低倍镜，后高倍镜，最后用油镜观察。五、实验结果将观察结果记入下表菌名菌体颜色细胞形态G+或G-枯草芽孢杆菌大肠杆菌六、思考题1、革兰氏染色法成败的关键是什么？为什么？2、革兰氏染色应选用何种菌龄的细菌？为什么？实验三 细菌的芽孢染色一、实验目的 学习并初步掌握细菌的芽孢染色法，观察芽孢细菌的形态特征。二、实验原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，用一般染色法仅能使菌体着色，芽孢呈透明的轮廓。但是芽孢一旦着色后，脱色也比较困难，因此，所有芽孢染色法都基于同

8、一原则：除了采用着色力强的染料外，还需要在加热情况下操作，以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽孢上的染料仍然保留。经复染后，菌体和芽孢即分别呈现不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。三、实验仪器与材料1、菌种: 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面上培养2436小时的枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌2、试剂: 孔雀绿染色液、番红染色液孔雀绿染色液：孔雀绿5.0g、蒸馏水100.0mL。用蒸馏水溶解即成5%孔雀绿染色液。3、仪器或其它用具: 显微镜、酒精灯、沸水浴、小试管、试管夹、洗瓶及废液缸、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。四、实验步骤孔雀绿-番红染色法（Schaeffe

9、rFulton改良染色法）：1、制菌液：取一支小试管，加蒸馏水12滴，用接种环从斜面上挑取芽孢杆菌23环，混于试管蒸馏水中，充分打匀，使成均匀而浓稠的菌液。2、加染料：加约23滴的孔雀绿染色液于小试管中，摇匀。3、加热染色：将试管置于沸水浴中加热1520分钟。4、制涂片：用接种环取加热后的染色菌液于洁净的载玻片上，涂成薄膜，干燥后于酒精灯火焰上固定。5、脱色：用缓流水洗至无绿色流出。6、复染：甩去玻片上多余的水分，滴加番红染色液12滴，复染5分钟后倾去染液，水洗，用吸水纸吸干，充分干燥。7、镜检：先低倍镜，后高倍镜，最后用油镜观察。五、实验结果将芽孢染色观察结果记入下表：菌种芽孢的形态芽孢的颜

10、色六、思考题在芽孢染色过程中，为什么要加热？实验四 霉菌水浸标本片的制备与观察一、实验目的1学习并掌握自制水浸片并观察霉菌的形态。2了解三类常见霉菌的基本形态特征。二、实验原理霉菌的的营养体是分枝的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝又可分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可形成不同的孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝粗大，通常为细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。但霉菌细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，故制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身

11、呈蓝色，有一定染色效果。三、实验仪器与材料1、菌种：用马铃薯葡萄糖琼脂平板培养25天的黑曲霉、青霉、根霉2、试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10.0g、乳酸（相对密度1.21）10.0mL、甘油20.0mL、蒸馏水10.0mL、棉蓝0.02g。将石炭酸加在蒸馏水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝即成。3、仪器或其它用具：显微镜、接种环、载玻片、盖玻片、蒸馏水、酒精灯、无菌平皿等。四、实验步骤1、制水浸标本片在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用接种环从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后

12、放入载玻片上的液滴中，仔细地用接种针将菌丝分散开来（注意不要涂），盖上盖玻片。2、先用低倍镜观察，必要时转换高倍镜观察，记录观察结果。五、实验结果绘出不同霉菌自然生长的形态图，并注明各部位的名称。六、思考题描述一下各种霉菌在PDA平板上的菌落特征。菌落的形态（绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状）、光滑（粗糙）、湿润（干燥）、质地紧密（疏松）、是否透明、是否容易挑取、菌落的颜色、菌落正反面及中央与边缘的颜色是否一致。实验五 牛奶中菌落总数的测定技术一、实验目的 学习和掌握平板活菌计数法的基本原理和方法。二、实验原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数，主要

13、作为判别食品被污染程度的标志。菌落总数测定最常用的方法是平板活菌计数法，即将待测样品经适当稀释后，制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，取一定量的稀释液和适量的培养基于平板中混匀，经培养后，平板上出现单一菌落，即为一个菌落形成单位（CFU），根据平板上长出的菌落数，计算每g（mL）样品中的含菌数。 三、实验器材1、检样：鲜牛奶 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水 3、仪器用具：恒温培养箱（37）、恒温水浴锅、酒精灯、试管（18*180mm）、试管架、无菌培养皿、无菌移液管（10mL和1mL）、电炉、pH试纸（pH 5.59.0）、锥形瓶（300mL和500mL）、电子天平、高压蒸汽

14、灭菌锅、酒精棉球、打火机等。 四、实验步骤1、取样：以无菌操作取样。2、样品的稀释： 以无菌操作吸取检样25 mL，放于盛有225mL灭菌生理盐水的三角瓶中，振摇10min，制成1:10的均匀稀释液。 取1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中，振摇混匀，制成1:100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。根据样品情况，做成 10-3、10-4、10-5稀释液。3、 检样的吸取：另取一支1mL吸管，从生理盐水开始依次10-5、10-4、10-3各吸取1m

15、L注入无菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。4、培养：将稀释液移入平皿后，将凉至46的营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）温箱内培养（48±2）h。5、菌落计数：可用肉眼观察，必要时可用放大镜观察，记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。（1） 选取菌落数在30300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计，每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。（2）其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应

16、以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表一个平板菌落数。（3）当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则应每条链作为一个菌落计数。6、结果报告（1）菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按下式计算:式中：N：样品中菌落数；C：平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1：第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2：第二稀释度（高稀释倍数）

17、平板个数；d：稀释因子（第一稀释度）。若所有稀释度的平板菌落总数均大于300CFU，则对最高稀释度的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落总数均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落总数均不在30300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU，或大于300 CFU，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度的平板（包括液体样品的原液）均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数计算。（2） 报告：单位CFU/g（mL）五、实验结果 1、结果 项目10-310-

18、410-5菌落总数2、计算3、经测定牛乳中的菌落总数是：六、思考题1、为什么要对检样进行稀释处理？ 2、食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？为什么？ 3、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在46±1的温度？实验六 食品中金黄色葡萄球菌的测定一、实验目的学习和掌握食品中金黄色葡萄球菌的检测原理及方法。二、实验原理葡萄球菌在自然界分布极广，土壤、空气、水、食品以及人和动物的体表粘膜处均有存在，大多不致病，也有一些致病球菌，金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病力最强的一个种，与食物中毒关系最密切，可引起皮肤组织炎症，还能在食品中生长繁殖，产生肠毒素，人误食了含有毒素的食品就会引起

19、食物中毒，故食品中生长金黄色葡萄球菌是对人体健康的一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有重要的实际意义。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm。金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖

20、、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。三、实验器材1、检样：新鲜牛乳2、仪器和材料恒温培养箱、恒温水浴箱、天平、显微镜、电炉、锥形瓶（300mL和500mL）、无菌培养皿、无菌吸管（10 mL和1mL）、试管（18*180mm）、载玻片、接种环、涂布棒、pH试纸（pH 5.5-9.0）、试管架3、培养基及试剂胰酪胨大豆肉汤:成分：胰酪胨（或胰蛋白胨）17g，植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g，氯化钠100g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL。制法：将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶液，分装后12115min高压灭菌。最终pH7.3±0.2。 7.5

21、%氯化钠肉汤:成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠75g，蒸馏水1000mL，pH7.4。制法：将上述成分加热溶解，校正pH，分装试管，12115min高压灭菌。血琼脂平板:成分：豆粉琼脂100mL，脱纤维羊血（或兔血）510mL。制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。Baird-Parker琼脂平板:成分：胰蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏1g，丙酮酸钠10g，甘氨酸12g，氯化锂（LiCL·6H2O）5g，琼脂20g，蒸馏水950mL，pH7.5。增菌剂的配法：3050%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶

22、液10mL混合，保存在冰箱内。制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25，矫正pH。分装每瓶95mL，121高压灭菌15min。临用时，加热融化琼脂，冷至50，每95mL加入预热至50的卵黄-亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。肉浸液肉汤:成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，蒸馏水1000ml。制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐

23、，溶解后校正pH7.47.6，煮沸并过滤，分装烧瓶，121高压灭菌30min。兔血浆：成分：柠檬酸钠0.106 mol/L（31.3g Na3C6H5O7·2H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。灭菌盐水、革兰氏染色液四、实验步骤1、增菌培养法样品处理：无菌取25g或25mL样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。增菌培养：吸取5mL的10-1稀释液，接种于50mL的7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，置（36±1）°C培养24h。分离培养：用接种环从有细菌生长的增菌培养基中取菌

24、一环，划线接种于血平板和Baird-Parker平板，置（36±1）°C培养24h。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径23mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。染色观察：从血平板和Baird-Parker平板上挑取金黄色葡萄球菌可疑菌落进行革兰氏染色。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，显微镜下呈葡萄状排列,无芽孢、荚膜，直径0.51m。血浆凝固酶试验：挑取可疑金黄色葡萄球菌接种到肉浸液肉汤培养基内，于（36±1）°C培养24h。吸取0.5mL兔血浆，放入小试管中，再加入0

25、.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物，充分混匀，置（36±1）°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。报告：报告每25g（mL）食品中金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性或者阴性。 2、直接计数法样品处理：同“增菌培养法”。样品稀释：吸取上述1:10混悬液，进行10倍递增稀释。分离接种：根据样品污染情况，选择适宜浓度的稀释液1mL，分别加入三个Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0.3 mL，0.3 mL，0.4mL，然后用灭菌涂布棒涂布整个平板。菌落计数：在三个平板上将周围

26、有浑浊带的黑色菌落计数。接种血平板：任选5个菌落，分别接种血平板，（36±1）°C培养24小时后进行革兰氏染色镜检。血浆凝固酶试验：步骤同“增菌培养法”。报告：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，即可求出每g样品中金黄色葡萄球菌数。 五、思考题1、简述金黄色葡萄球菌的检验程序。2、怎样预防金黄色葡萄球菌引起的食物中毒？实验七 国标法测定食品中的大肠菌群一、实验目的学习和掌握食品中大肠菌群的检测方法及检测结果的报告方式。二、实验原理大肠菌群是指一群在37培养24h能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群主要来源于

27、人类粪便，可作为食品被粪便污染的指标菌。本实验利用大肠菌群上述生化特征进行培养分离和证实，以反映食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。三、实验器材1、检样：新鲜牛乳2、仪器和材料高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温水浴箱、天平、显微镜、锥形瓶（500mL）、无菌培养皿、无菌吸管（10mL和1mL）、试管（18*180mm）、载玻片、接种环、试管架、pH试纸（pH 5.5-9.0）、酒精灯等3、培养基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤:成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCl 5.0g，乳糖5.0g，K2HPO4  2.75g，KH2PO4 2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤:成分：蛋白胨10.0g、乳糖10.0 g、牛胆粉( oxgall或oxbile)溶液200mL、0.1%煌绿水