CNE-2细胞增殖、凋亡检测方法

1、CNE-2细胞增殖、凋亡检测方法1. 目的2. 技术路线3. 试剂、溶液、耗材、仪器、实验材料4. 操作步骤：1). MTT法检测CNE-2细胞增殖步骤：(贴壁细胞法)1. Fen细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。2. 取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培 养箱中培养24小时，让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10：1到50：1，继续培养4小时，让效

2、应细胞发挥杀伤效应。实验中，设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有 效应细胞的阴性对照，每种处理设3各复孔。3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔 3次，洗去不粘附的细胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培养液和10l 5mg/ml的MTT染液，继续培养3小时。4. 用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30分钟，溶解形成的结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照) /OD无杀伤对照× 100。MTT法应注意事项：1.选择适当的细胞接种浓度。一般情

3、况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后

4、得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。4.培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔

5、都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。MTT配制：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相

6、对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的

7、照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调pH 7.4定容1L2). CCK-8法检测CNE-2细胞增殖CCK法的操作步骤（更多内容请见说明书）：实验一：细胞活性检测1、在96孔板中接种细胞悬液（100L/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37,5% CO2）。2、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 L

8、 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。活力计算：细胞活力*（）=A(加药)-A（空白）/A（0加药）-A（空白） ×100A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度检测步骤1. 向各孔中加入100 l细胞悬液。a)2. 在 37下预孵育培养板。b)3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 l。4. 37下孵育。5. 向各孔中加入10 l的CCK-8溶液d)。6. 37下孵育

9、1-4小时。e)7. 测定450 nm处的OD值。a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。c) 使用培养基或PBS来制备溶液。d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 l培养基和10 l CCK-8进行检测。e) 白细胞可能需要培养较长时间。3). Annexin-V法检测CNE-2细胞凋亡二、实验仪器和材料 Annexin V-FITC（膜

10、联蛋白-V-FITC） 20g/ml 标记缓冲液（Binding Buffe） 20 ml PBS（1×） 30 ml 量程分别为20l , 200l 和1000l的移液器及吸头 微量离心管 可调速离心机 载玻片（用于荧光显微镜观察），盖玻片（用于荧光显微镜观察） 去离子水，冰块 流式细胞仪或荧光显微镜 三、实验方法 1凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。 2200l细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4离心10分钟，弃上清。 3重

11、复步骤2两次。 4将细胞重悬于200l 标记缓冲液。 5加入10l Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4反应30分钟。 6 加入300l标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）或荧光显微镜观察检测。 四、 实验结果 用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。 五、注意事项 1整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4下操作。 3反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，

12、反应一小时后荧光强度就开始衰变。 4 Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。4). Tunel法及检测CNE-2细胞凋亡(一)试剂配制1、磷酸缓冲液PBS(pH7.4)：磷酸钠盐 50mM,NaCl 200mM.2、蛋白酶K(200g/ml,pH7.4)：蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml.3、含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4)：H2O2 2.0ml;PBS缓冲液 98.0ml.4、TdT酶缓冲液(新鲜配)：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸钠 29.96g和氯化钴0.238g.5

13、、TdT酶反应液：TdT酶32l;TdT酶缓冲液 76l,混匀,置于冰上备用.6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4g;柠檬酸钠 8.82g;ddH2O 1000ml7、0.05%二氨基联苯(DAB)溶液：DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 临用前过滤后,加过氧化氢至0.02%.8、0.5%甲基绿(pH4.0)：甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml.9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等.10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)(二)实验步骤1、标本预处理：（有3种方法）a) 石蜡包埋的组织切片预

14、处理： 将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min； 用无水乙醇洗两次，每次3min； 用95%乙醇洗一次，3min，再用75%乙醇洗一次，3min； 用PBS洗一次，5min； 加入蛋白酶K溶液(20ug/ml)，在室温水解15min，去除组织蛋白； 用蒸馏水洗4次，每次2min，备用。b) 冰冻组织切片预处理： 将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，置于室温固定10min后，用滤纸吸去多余液体； 用PBS洗两次，每次5min； 放入乙醇：乙酸(2：1)的溶液中，置于-20处理5min，用滤纸吸去多余液体； 用PBS洗两次，每次5min，备用。c) 培养的或从组织分离的细胞的预处理：

15、将约 5 × 107个/ml细胞置于 4%中性甲醛室温中固定10min； 在载玻片上滴加 50-100l细胞悬液并使之干燥； 用PBS洗两次，每次5min。备用。2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min.用PBS洗两次,每次5min.3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液,置室温15min.4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加 54l TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应 1hr(注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液).5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37的洗涤与终止反应缓冲液,于37保温30min

16、,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动.6、组织切片用PBS洗 3次,每次 5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min.7、用PBS洗4次,每次5min.8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液,室温显色36min.9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min.10、于室温用甲基绿进行复染10min.用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s.依同样方法再用100%正丁醇洗三次.11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果.(三)注意事项细胞凋

17、亡检测试验中一定要设计阳性和阴性对照样本。可以采用不加TdT酶的作为阴性对照组，利用DNaseI部分降解的细胞作为阳性对照组。(二)材料与试剂1.采用Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗体。2.过氧化物酶(-POD)标记的小鼠抗DNA单克隆抗体3.链霉亲合素包被的微孔板4.DNA-组蛋白复合物，作为阴性对照。5.ABTS底物6.溶解缓冲液7.温育缓冲液8.底物缓冲液(三)样品1.培养细胞或离体细胞的裂解物细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。2.培养细胞的上清液3.血浆(血清)(四)操作方法

18、1.取样品离心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。2.另加入80µl免疫反应试剂含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液(按1118混合)，室温下孵育2h(置摇床上，250r/min)。3.取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。4.加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合(置摇床上)。5.尽快作比色分析(10min20min内)，用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。(五)结果判定按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：注：mU=吸收值(10-3)=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。5). ELISA