欧洲药典EP50

1、2.6.14 细菌内毒素细菌内毒素实验是使用来自鲎（美洲鲎或东方鲎）的阿米巴细胞溶解物用于检测或定量革兰氏阴性细菌的实验。本实验有三种检测技术：基于凝胶形成的凝胶法技术；基于内源性基质断裂后浊度的变化的浊度法技术；基于带有生色团的合成肽断裂后的颜色的变化的显色法技术。本章介绍了下列6种方法：方法A凝胶法：限量实验方法B凝胶法：半定量实验方法C动态浊度法方法D动态显色法方法E终点显色法方法F终点浊度法可使用6种方法中的任何一种进行实验。如果出现怀疑或争议，除非文中另有规定，否则以方法A的结果为准。实验应在可避免污染的方式下进行。器 具将所有的玻璃器皿和其它遇热稳定的器具置于热空气烘箱中用经验证的

2、的方法除热原，常用的最少时间和温度是250 30分钟，如果使用塑料器具，如用于自动移液器的微量滴定板和移液吸头，应使用经证实无可测内毒素及对实验无干扰的器具。注：在本章中，“试管”这个词泛指所有容器，例如微量滴定板孔内毒素标准品原液的制备内毒素标准品复溶原液是用经过国际标准品校准的内毒素参考标准品制备的，例如内毒素标准品BRP。内毒素以国际单位（IU）表示，世界卫生组织规定国际标准品等于1 IU。注：1 IU=1 EU按照产品说明书和标签上的说明制备和储存内毒素标准品复溶液。内毒素标准品溶液的制备将内毒素标准品原液强力混合后，用细菌内毒素检查用水（检查用水）稀释本复溶液制备合适的内毒素稀释液系

3、列。稀释液应尽快使用以避免因吸附导致的活性损失。供试品溶液的制备用细菌内毒素检查用水溶解或稀释活性物质或药品制备供试品溶液，某些物质或产品可能更适合用其它水性溶液进行溶解或稀释。如果有必要，调整供试品溶液的PH值以使试剂和供试品溶液的混合物的PH在试剂生产商所指定的范围内。这通常适用于PH值范围在6.0-8.0之间的产品，PH值可按试剂生产商的推荐用酸、碱或缓冲液调节。酸碱可用细菌内毒素检查用水在无热原的容器中用原液或固体制备。缓冲液必须经验证无可测内毒素和干扰因子。最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数（MVD）是允许的样品的最大稀释倍数，在此稀释倍数下可确定内毒素限值。内毒素限值：非经肠道

4、给药的活性物质的内毒素限值，用剂量定义，等于：K/MK=每小时每公斤体重的内毒素阈热原剂量M=每小时每公斤体重产品的最大推荐剂量非经肠道给药的活性物质的内毒素限值用IU/ml、IU/Unit等生物活性单位表示。供试品溶液的浓度表示方法：如果内毒素限值是以重量单位表示（IU/mg）则为mg/ml。如果内毒素限值以生物活性单位表示（IU/Unit）则为Units/ml如果内毒素限值以生物活性单位表示（IU/Unit）则为Units/ml=凝胶法技术中的标示灵敏度或浊度法或显色法技术的标准曲线的最低点凝胶法技术（方法A和B）凝胶法技术可以检测或定量内毒素，它是基于试剂在出现内毒素时形成凝胶的原理。在

5、标准条件下导致试剂形成凝胶所需要的内毒素浓度为试剂的标示灵敏度，为确保实验的精确和有效性，应按1. 预备性实验所述进行标示灵敏度复核实验和干扰实验。1. 预备性实验(i) 标示灵敏度复核实验在使用鲎试剂做实验前，应复核其标示灵敏度，以IU/ml表示，将试剂溶液重复4管进行实验。当使用新批号的试剂或任何可能影响实验结果的实验条件改变时应进行试剂灵敏度复核。用细菌内毒素检查用水稀释内毒素标准品原液制备相当于2、0.5、0.25的至少4个浓度的标准品溶液。在一支试管中将等量的试剂溶液和其中一个浓度的标准品溶液（如0.1ml）混合，如果是使用装有冻干试剂的单次实验小瓶或安瓿，可直接将溶液加入瓶中或安瓿

6、中。根据试剂生产商的建议将反应混合物恒温孵育一段时间（通常是37±1 60±2分钟），避免震动。检验凝胶的完整性：如果是试管，从恒温器中依次拿出每支试管，平稳地倒转大约180°一次，如果形成坚实的凝胶，倒转过来时不滑脱，结果记为阳性，如果未形成完整的凝胶，则结果记为阴性。如标准品溶液的最低浓度的所有重复管的结果均为阴性，则实验有效。终点是内毒素系列递减浓度中最后一个阳性结果，使用以下表达式计算终点浓度的对数平均值，然后求平均值的反对数：åe = 所用的稀释系列的终点浓度对数值的和f = 重复管数终点浓度几何平均值是试剂溶液（IU/ml）的测定灵敏度，如果

7、0.5ll2l，则标示灵敏度符合规定，用该批试剂进行实验时使用该灵敏度。(ii) 干扰实验按表2.6.14-1制备溶液A、B、C和D，供试品溶液稀释倍数不得大于MVD，不含有任何可测内毒素，按1. 预备性实验（i）标示灵敏度复核实验进行实验。表 2.6.14-1溶液内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释剂稀释倍数初始内毒素浓度重复管A无/供试品溶液-4B2l/供试品溶液供试品溶液12482l1l0.5l0.25l4444C2l/检查用水检查用水12482l1l0.5l0.25l2222D无/检查用水-2溶液A=无可测内毒素的供试品溶液溶液B=干扰对照溶液C=标示灵敏度对照溶液D=阴性对照（检查用水）

8、使用1. 预备性实验（i）标示灵敏度复核实验中给出的表达式确定溶液B和C的终点浓度的几何平均值。当有可能影响实验结果的实验条件改变时，重复干扰实验。所有溶液A和D的重复管均为阴性，溶液C符合标示灵敏度复核实验的规定，则实验有效。如果用溶液B确定的试剂灵敏度0.5ll2l，则供试品溶液在此实验条件下不含有干扰因素。否则溶液对实验有干扰。如果稀释倍数小于MVD的供试品溶液对实验有干扰，可使用更大的稀释倍数重复干扰实验，但不得大于MVD。使用高灵敏度的试剂允许用更大的稀释倍数制备供试品溶液，这有助于消除干扰。干扰可通过适当的处理克服，比如过中和、透析或热处理，为了确定所选择的处理方法能有效消除干扰而

9、又不会损失内毒素，可使用已加入内毒素并用所选择的处理方法处理过的供试品溶液重复干扰实验。2. 限量实验方法（方法A）（i） 实验过程按照表2.6.14-2制备溶液A、B、C和D，并按照1. 预备性实验（i）标示灵敏度复核实验叙述的过程进行实验。表2.6.14-2溶液内毒素浓度/加入内毒素的溶液重复管数ABCD无/稀释的供试品溶液2l/稀释的供试品溶液2l/检查用水无/检查用水2222用不大于MVD的稀释倍数制备溶液A和B（阳性产品对照），并用1. 预备性实验（ii）干扰实验中所述的处理方法处理。溶液B和C含有2l浓度的内毒素标准品，溶液D（阴性对照）为检查用水。（ii） 结果判断阳性对照溶液B

10、和C的两支重复管结果均为阳性，阴性对照溶液D所有重复管均为阴性，则实验有效。当溶液A的两支重复管结果均为阴性时，供试品检测合格。当溶液A的两支重复管中有一支为阳性时：如果供试品已稀释到MVD，产品不合格；如果供试品的稀释倍数小于MVD，用更大的稀释倍数稀释供试品重复实验，但不得大于MVD。3. 半定量实验（方法B）（i） 实验过程 本实验通过确定终点浓度来定量供试品溶液的细菌内毒素。按照表2.6.14-3制备溶液A、B、C和D，根据1. 预备性实验（i）标示灵敏度复核实验检测这些溶液。（ii） 计算和结果判断除非符合以下三个条件，否则实验无效：（a） 溶液D（阴性对照）的两支重复管结果均为阴性

11、；（b） 溶液B（阳性对照）的两支重复管的结果均为阳性；（c） 溶液C的终点浓度几何平均值在0.5和2范围之间要确定溶液A的内毒素浓度，可将每一终点对应的稀释倍数乘以l计算出每个稀释系列的每支重复管的终点浓度。供试品溶液的内毒素浓度是重复管的终点浓度的几何平均值（见1. 预备性实验（i）标示灵敏度复核实验中给出的表达式）。如果是用稀释的供试品溶液进行实验，用测得的浓度乘以稀释倍数计算原始溶液的内毒素浓度。在一个有效实验中，如果供试品溶液的稀释液的检测结果都不是阳性，内毒素浓度记为小于（或如果是检测稀释的样品，记为小于´样品的最小稀释倍数）。如果所有的稀释液结果均为阳性，内毒素浓度记为

12、大于等于最大稀释倍数乘以（例如表2.6.14-3中，初始稀释倍数´8´）。如果内毒素浓度小于规定的值，则供试品符合实验要求。光度法技术（方法C、D、E和F）1. 浊度法技术（方法C和F）该技术是测定浊度变化的一种光度法实验。根据所使用实验原理，该技术分为终点浊度法实验或动态浊度法实验。终点浊度法实验是基于内毒素浓度与反应结束时反应混合物的浊度（吸光度或透光度）之间的定量关系。动态浊度法实验（方法C）是一种测定反应混合物达到预定吸光度所需的时间（反应时间）或浊度变化率的方法。该实验应在试剂生产商推荐的恒温温度下进行（通常是37±1）。2. 显色法技术（方法D和E）该

13、技术是用来测定内毒素与鲎试剂反应中的显色肽释放出来的显色团。依据所使用的实原理验，本技术分为终点显色法实验或动态显色法实验。终点显色法（方法E）是基于反应结束时内毒素浓度与释放出来的显色团数量之间的定量关系。动态显色法（方法D）测定反应混合物达到预定吸光度所需的时间（反应时间）或颜色变化率。该实验应在试剂生产商推荐的恒温温度下进行（通常是37±1）。3. 预备性实验为了确保浊度法和显色法实验的精确性或有效性，需进行预备性实验以确保标准曲线符合规定以及供试品溶液不会干扰实验。当有可能影响实验结果的任何实验条件发生改变，要求对实验方法进行验证。（i） 标准曲线的可靠性实验使用内毒素标准品

14、溶液制备至少3个内毒素浓度建立标准曲线，每个浓度的内毒素标准品溶液至少重复3管并按照试剂生产商的建议（容液比例，恒温时间、温度、pH等等）进行实验。使用动态方法时，如果要求的范围大于两个对数数量级，则应该在标准曲线范围内添加额外标准品来支持每个对数数量级的递增。在试剂生产商指定的内毒素浓度范围内，相关系数的绝对值|必须大于等于0.980。（ii） 干扰实验选择一个内毒素标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度。按照表2.6.14-4制备溶液A、B、C和D，按照试剂生产商的建议（供试品溶液和试剂溶液的量，供试品溶液和试剂溶液的量的比例、恒温时间等等）至少重复2管进行实验。表2.6.14-3溶液内毒素浓

15、度/加入内毒素的溶液稀释剂稀释倍数初始内毒素浓度重复管A无/供试品溶液-1248-2222B2l/供试品溶液供试品溶液12l2C2l/检查用水检查用水12482l1l0.5l0.25l2222D无/检查用水-2溶液A=稀释倍数不超过MVD的供试品溶液，已做过干扰实验，供试品溶液的进一步的稀释亦不能超过MVD，根据干扰实验结果，使用检查用水制备两个稀释系列1，1/2，1/4和1/8，也可使用其它合适的稀释系列。溶液B=含有2l内毒素标准品的溶液A（阳性产品对照）溶液C=含有2l、l、0.5l、0.25l浓度的内毒素标准品的两个检查用水系列。溶液D=检查用水（阴性对照）表2.6.14-4溶液内毒素

16、浓度加入内毒素的溶液重复管数A无供试品溶液不少于2管B标准曲线中点浓度供试品溶液不少于2管C至少3个浓度（l为最低浓度）检查用水每个浓度不少于2管D无检查用水不少于2管溶液A=供试品溶液，可用不大于MVD的稀释倍数稀释。溶液B=含中点浓度的供试品溶液，与溶液A稀释倍数相同溶液C=内毒素标准品溶液，浓度同3. 预备性实验（i）标准曲线可靠性实验（阳性对照）的验证实验中的浓度。溶液D=检查用水（阴性对照）用含有添加内毒素的供试品溶液的平均浓度减去未添加内毒素的供试品溶液的平均浓度来计算添加的内毒素的平均回收率。如果在实验条件下，测得加入供试品溶液中的内毒素的浓度在已知添加的内毒素浓度的50%-20

17、0%范围内，则供试品溶液无干扰。当内毒素回收率超过指定范围，应按照凝胶法技术中1. 预备性实验（ii）干扰实验所述的方法去除干扰因子。4. 实验(i) 过程按3. 预备性（ii）干扰实验的实验过程。(ii) 计算使用阳性对照系列溶液C创建的标准曲线计算溶液A的每支重复管的内毒素浓度。实验只有符合以下三个要求才有效：（a）溶液D（阴性对照）的结果不超过所使用的试剂要求的空白值的限值；（b）阳性对照系列溶液C的结果符合3.预备性实验（i）标准曲线可靠性实验中所定义的验证的要求（c）用溶液B的内毒素浓度减去溶液A的内毒素浓度计算出来的内毒素回收率在50%-200%范围内。(iii) 判断如果溶液A的重复管的内毒素浓度平均值小于产品的内毒素限值，则所检产品合格。5. 试剂（i）