抗生素类药物的分析2PPT课件

1、 第一节 概 述一、 抗生素药物的特点（一）定义 抗生素（antibiotics） 在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。第1页/共136页（二）抗生素的来源1、生物合成（发酵）： 生物包括微生物（真菌、放线菌、细菌等）、植物、动物。 2、化学合成或半合成第2页/共136页（三）抗生素质量的复杂性（三）抗生素质量的复杂性 产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用同系物多；异构体多；降解物多化学纯度低生产工艺复杂，发酵过程不易控制活性成分易发生变异第3页/共136页 二、抗生素药物的质量分析 抗生素药物的质量控制方法与一般化学药品一样，通过

2、鉴别、检查、含量（效价）测定三个主要方面来判断其质量的优劣。 第4页/共136页（一）鉴别实验（理化方法） 1官能团的显色反应 2光谱法 3色谱法 4生物学法（抑菌能力）第5页/共136页 （二）检查 1影响产品稳定性的指标 2控制有机和无机杂质的指标 3与临床安全性密切相关的指标 4其他指标 第6页/共136页（三）含量测定或效价测定 1微生物检定法 以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价（potency）的一种方法。 其测定方法有稀释法、比浊法、管碟琼脂扩散法第7页/共136页优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长2、测定误差大第8页

3、/共136页2理化方法 根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学及反应而进行的。优点1、准确度高2、简单、快速1、不一定代表生物效价缺点2、易受杂质干扰第9页/共136页 3、抗生素活性表示方法 抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用单位（u）表示或微克（g）表示。第10页/共136页三、抗生素的分类（按结构与性质）： 内酰胺类、 氨基糖苷类、 四环素类、 大环内酯类、 多烯大环类、 多肽类 苯烃胺类、 蒽环类第11页/共136页 本类抗生素包括青霉素族和头孢霉素族，它们的分子结构中均含有-内酰胺环，因此统称为-内酰胺类抗生素。第二节 -

4、内酰胺类抗生素第12页/共136页（一）青霉素类NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第13页/共136页CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素青霉素（青霉素G、苄青霉素）第14页/共136页阿莫西林（羟氨苄青霉素）阿莫西林（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH第15页/共136页C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2第16页/共136页（二）头孢菌素类7654321NONHSCH2R1COOHRCO母核（7-氨基头孢菌烷酸）第17页/共136页NONHSCH3COOHOCNH2CH第1

5、8页/共136页头孢拉啶头孢拉啶CHNH2CONONHSCH3COOH第19页/共136页头孢羟氨苄头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CHHO第20页/共136页NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性化学性质Na1、与碱金属(Na+、K+)成盐，易溶于水 （一）羧基：酸性 第21页/共136页2、与有机碱（普鲁卡因）成盐 难溶于水普鲁卡因青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2第22页/共136页NSO1234567（二）手性（二）手性C C：旋光性：旋光性 87654321NOS（5%头孢唑啉钠溶液 1824）20D 2、头孢菌素类

6、C6 C71、青霉素类 C3 C5 C6 旋光性第23页/共136页（三）共轭体系（三）共轭体系 ： UVUV吸收特性吸收特性NSO2、头孢菌素类 母核有共轭体系 1、青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基 NOS第24页/共136页青霉素钠UV7-20第25页/共136页第26页/共136页（四）（四）内酰胺环内酰胺环 ：不稳定性：不稳定性 水溶液 不稳定 干燥纯净 稳定 不稳定性因素四元环张力大 酰胺键易水解 第27页/共136页（某些金属离子）（温度）某些氧化剂失效降解青霉素类酸、碱、青霉素酶第28页/共136页例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸H2OpH2

7、100青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2第29页/共136页内酰胺酶-b失效降解头孢菌素类酸、碱、胺类例：头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%第30页/共136页二、鉴别反应（一）呈色反应1、 羟肟酸铁反应-内酰胺类NaOH呈色Fe3+/3H+羟肟酸衍生物-b2HClNOHH内酰胺类第31页/共136页2、 类似肽键的反应（1）茚三酮反应 -氨基蓝紫色氨基茚三酮-NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH第32页/共136页（2）双缩脲反应-内酰胺类 CONH（开环分解）紫红色内酰胺类碱性酒石酸铜-b第33页/共136页3、其他呈色反应（1） 与重氮苯磺酸反

8、应酚羟基例：头孢哌酮（偶合）橙黄色重氮苯磺酸-56OHHC第34页/共136页（2） 与变色酸-硫酸反应青霉素阿莫西林氨苄西林活泼“-CH2-”（分解）变色酸显色HCHOCHSOH-422”羰基侧链含“第35页/共136页150（缩合）42变色酸阿莫西林HCHOSOH色褐NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH第36页/共136页SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）D第37页/共136页（3）与H2SO4 - HNO3反应头孢菌素类亮黄红棕黄色头孢噻肟钠头孢噻吩钠头孢氨苄3-42HNOSOH第38页/共136页（4） 与铜盐反应橄

9、榄绿色NaOH专属反应 4CuSOHAc头孢氨苄第39页/共136页二、（二）各种盐的反应1、K+、Na+的火焰反应鉴别 焰色鲜黄色 + 醋酸氧铀锌黄 Na+ 焰色紫色 + 0.1%四苯硼钠 + Ac白 K+第40页/共136页2、重氮化 - 偶合反应 芳伯氨基重氮化-偶合反应青霉素普鲁卡因普鲁卡因青霉素+H红第41页/共136页3、 遇酸在过量HCl或有机溶剂中溶解白青霉素青霉素钠青霉素钾+H第42页/共136页1、IR法-内酰胺环酰胺115251680=cm、VOC117501800=cmVOC（三）光谱法NHV=13300cmCOOHV114101600cm、羧基第43页/共136页第4

10、4页/共136页2、UV法样品、分解产物头孢氨苄 max = 262nm青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50Cu2+苯唑青霉烯酸苯唑西林钠+HnmA339A,Emin ,max ,%cm11光谱图第45页/共136页第46页/共136页氯唑青霉素 341 0.682双氯青霉素 342 0.653苯唑青霉素 339 1.328max %cmE (nm) ml/g 第47页/共136页（四）色谱法1、TLC法对照品对照法2、HPLC法和斑点颜色比较供试品对照品相同条件fRRt比较供试品对照品相同条件第48页/共136页三、特殊杂质的检查 本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合

11、物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。第49页/共136页（一）聚合物 中国药典对头孢他啶、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠等规定了各自聚合物的检查。（二）有关物质和异构体 通常采用色谱法（HPLC、反相TLC法等）检查-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体。第50页/共136页（三）吸收度 药典常采用测定杂质吸收度的方法来控制本类抗生素的杂质含量。例如：将青霉素钠（钾）配成1.80mg/ml的溶液，在280nm处的A0.10（控制杂质量）；264nm处的A为0.800.88（检查药物量）。第51页/共136页四、含量测定 本类药物多采用理化测定方法

12、进行含量测定，Chp收载的主要方法有：碘量法、电位配位滴定法、可见 紫外分光光度法、HPLC法等。第52页/共136页（一）碘量法1、原理水解产物定量过量剩余-内酰胺类（水解）+H482IINaOH头孢菌素族青霉素族64232222OSNaNaIOSNaIH+第53页/共136页 反应分两步进行：（1）水解反应 (按化学计算量进行)（2）氧化-还原反应 (无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定)第54页/共136页V样空V样对照液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴 V对空V对供试液+缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴

13、2、方法第55页/共136页 空白试验A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的 干扰C、消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定第56页/共136页 采用标准品平行对照测定A、可消除温度、pH、操作、环境等条 件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一 致第57页/共136页3、条件（1）弱酸性 pH4.5碱 I2 IO3- + I-酸 普鲁卡因与碘在酸性条件下会产 生复盐沉淀（2）温度 2426温度38 未水解的供试品亦消耗碘第58页/共136页（3）水解时间以水解20分钟后的耗碘量最大（4）反应时间 反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减少含量测定的误差。

14、第59页/共136页4、特点（1）灵敏度高样品 : 碘 = 1 : 8（2）反应条件、实验操作要求高V对、V对空V样、V样空1份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同4I28I-第60页/共136页5、计算占标示量平均装量样品稀释倍数%WCVVVV对照品）（）（样对对对空样样空样品标示量100%第61页/共136页（二）电位配位滴定法汞量法1、原理：青霉素族（水解）SHROH-青霉素族HgRS2）（64.pH+2Hg第62页/共136页2、方法 降降空空醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液VNOHg2 23 3pH4.6滴定样品 以未经水解的样品作空白测定()醋酸盐缓冲液pH4.6滴定水解( )总样VNO

15、HgHNONaOH233第63页/共136页例苯唑西林钠 含量测定 取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录 A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定,（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时第64页/共136页消 耗 滴 定 液 的 量 。 每 1 m l 硝 酸 汞 滴 定 液(0.02mol/L)相当于8.029mg的总苯唑西林 (按

16、C19H19N3O5S计算)。 另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点 判 断 方 法 同 上 。 每 1 m l 硝 酸 汞 滴 定 液（0.02mol/L）相当于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S计算）。 总苯唑西林的百分含量与降解物的百分含量之差值即为苯唑西林的含量。第65页/共136页3、讨论（1）以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点 （2）反应摩尔比 1 : 1（3）空白试验 消除已降解产物干扰（4）优点 不需标准品第66页/共136页4、计算%FTWVWV% = =

17、）（含量含量空空空空样样样样%WFTV%WFTV%=空空样样含量第67页/共136页1、硫醇汞盐法（1）原理青霉素族（咪唑）青霉烯酸硫醇汞盐青霉素族2HgClnmmax345324（三）可见-紫外分光光度法第68页/共136页（2）方法对照品法pH9标样咪唑硼酸缓冲液标准液供试液AAHgCl2（3）讨论a、咪唑催化的水解产率高，硫醇汞盐 稳定（3h）第69页/共136页pH9OCHCH223b、侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙 酰化后才能发生上述反应 NSOHNCOOCH3CH3OCCHNH2NaNSOHNCOONaCH3CH3OCCHNHCOCH3第70页/共136页（4）特点a、简便快速

18、b、用标准品对照，重现性良好， RSD1%第71页/共136页（水解）2、酸水解 铜盐法（1）原理稳定剂青霉素族nmCupHA324 +2青霉烯酸青霉素族第72页/共136页（2）方法（3）特点实验条件随各药物稳定性不同而定标准品对照法标样枸橼酸硫酸铜标准液供试液AAnmA-320第73页/共136页3、羟肟酸比色法Fe3+/3H+红色-内酰胺类NaOHb2HClNOHH内酰胺类羟肟酸衍生物第74页/共136页（四）HPLC法头孢菌素类内标法校正因子外标法特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）第75页/共136页 哌拉西宁 原料药 含量测定 色谱条件 用十八烷

19、基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。第76页/共136页第三节 氨基糖苷类抗生素苷苷苷元苷元糖糖缩合缩合 + +链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素氨基糖苷苷元氨基糖缩合 +第77页/共136页链霉素链霉胍链霉胍 + + 链霉糖链霉糖 + N-+ N-甲基甲基-L-L-葡萄糖葡萄糖胺胺 苷元糖链霉双糖胺第78页/共136页NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺第

20、79页/共136页NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺第80页/共136页庆大霉素 糖 苷元绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺 糖 第81页/共136页ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺第82页/共136页ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺第83页/共136页 庆大霉素庆大霉素C C

21、复合物复合物 庆大霉素庆大霉素C C1 1 R=H R=H R R1 1、R R2 2=CH=CH3 3 庆大霉素庆大霉素C C2 2 R=RR=R2 2=H =H R R1 1=CH=CH3 3 庆大霉素庆大霉素C C1a 1a R R、R R1 1、R R2 2=H=H 庆大霉素庆大霉素C C2a 2a R=CHR=CH3 3 R R1 1= = R R2 2=H =H 庆大霉素庆大霉素C C2b 2b R=RR=R1 1=H =H R R2 2=CH=CH3 3第84页/共136页一、化学性质链霉素 3个庆大霉素 5个碱性中心多与硫酸成盐碱性（一）水溶性溶解性（二）旋光性（三）第85页/

22、共136页链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212 稳定UV（五）稳定性（四）链霉素水解产物反应（六）链霉素 max 230nm第86页/共136页NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应第87页/共136页鉴别试验 茚三酮反应（一）羟基胺结构蓝紫色庆大霉素链霉素茚三酮 -氨基第88页/共136页（二）Molisch试验（糖类反应） 蓝紫色庆大霉素（六碳糖）链霉素（五碳糖）-萘酚H+糠 醛羟甲基糠醛蒽 酮红紫色第89页/共136页N-甲基葡萄糖胺反应（三）（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH

23、-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解- N第90页/共136页 链霉糖特有反应 麦芽酚反应（四） H+分子重排链霉糖链霉素-OH麦芽酚紫红色 +3Fe第91页/共136页NOH8-羟基喹啉- 萘酚OH（或-萘酚）橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠-8OH链霉胍特有反链霉胍特有反应应坂口反应（五）第92页/共136页（六）硫酸盐反应UV法（七）IR法（八）庆大霉素无UV吸收TLC法（九）H+白 424+2BaSOSOBanmmax230=链霉素第93页/共136页三、特殊杂质检查及组分分析 链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）2、方法 TLC中的对照品法（BP）

24、1、来源 反应中间体第94页/共136页对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分的测定（二）第95页/共136页衍生化原理 1、max =330nm+410.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基第96页/共136页1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物RNH2+HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOH第97页/共136页RPHPLC方法 2、规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%计算 3、峰面积归一化法%100%2211+=CCCCiiAAAAAAaa

25、第98页/共136页第99页/共136页含量测定链霉素、庆大霉素（一） 微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第100页/共136页（二）（二）HPLCHPLC法：血清中庆大霉素的测法：血清中庆大霉素的测定定血浆样品的预处理血浆样品的预处理离子对色谱法的目的：离子对色谱法的目的： 除去氨基酸、肽、胺的干扰除去氨基酸、肽、胺的干扰选用选用OPA OPA 为荧光衍生化试剂为荧光衍生化试剂采用柱后衍生化法采用柱后衍生化法 第101页/共136页2CH3NRR3HOHCONH2OO

26、HOHOOHR2R1第四节 四环素类抗生素ABCD第102页/共136页2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1123456789101112第103页/共136页2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO四环素（四环素（TCTC）tetracyclinetetracycline第104页/共136页2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOCl金霉素金霉素 (CTC) chlortetracycline(CTC) chlortetracycline氯四环素第105页/共136页2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HOOH土霉素土霉素 (OTC)

27、 oxytetracycline(OTC) oxytetracycline氧四环素第106页/共136页2CH3NRR3HOHCONH2OOHOHOOHR2R1第107页/共136页两性（一）1、与酸、碱均能成盐2、强酸或强碱中溶解度 酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性二甲胺基 弱碱性一、结构与性质第108页/共136页吸湿性（二）多含结晶水与金属离子生成有色配位化合物Ca2+ Mg2+ Fe3+ Al3+ UV和荧光（四）与金属离子络合（五）旋光性（三）第109页/共136页HOHOCaOOOOHOHOO第110页/共136页不稳定性（六）1、差向异构化：A环淡黄黑蓝色荧光差向金霉素差向四环素金霉素

28、四环素-4-462pH第111页/共136页OHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHO差向四环素2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HO第112页/共136页2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHR2R1HO（土霉素、多西环素不易差向异构化）第113页/共136页2、降解反应：C环（1）酸性下降解max = 445nmmax = 435nm橙黄色脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素2pH第114页/共136页2CH3NHOHCONH2OOHOHOOHCH3HON CH3 2HOHCONH2OOHOOHCH3OH脱水四环素第115页/共136页2CH3NHOHCONH2OO

29、HOHOOHCH3HOpH26pH26TCOHCONH2OOHOHOOHCH3HCH32NHOETCN CH3 2HOHCONH2OOHOOHCH3OHATCN2CH3OHCONH2OOHOHOHOCH3HEATCpH2pH2第116页/共136页（2）碱性下降解HOHCONH2OOHOHOOHCH3ON CH3 2（荧光）异四环素四环素 -OH第117页/共136页二、鉴别试验H2SO4反应（一）黄 色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH第118页/共136页（二）FeCl3反应褐 色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeCl第11

30、9页/共136页（三）Cl-反应（四）TLC法白+3+AgClAgClHNO正相分配薄层色谱EDTA 克服痕量金属造成的拖尾现象第120页/共136页（五）荧光法 OHUV绿色荧光H+UV土霉素金霉素四环素绿色荧光蓝色荧光黄色荧光第121页/共136页三、特殊杂质检查 4-差向四环素（ETC） 脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（CTC） 有关物质（一）TLC法（1995版）HPLC法（2000版）标准品对照法例：盐酸四环素第122页/共136页四环素有关物质TLC图I. 供试液( 5 mg/ml)II. ETC( 0.2 mg/ml)III. ATC( 0.025 mg/ml)IV. EATC ( 0.025 mg/ml)V. CTC ( 0.1 mg/ml)VI. 混合液40.50.52第123页/共136页吸收度（二）nmmax355268、盐酸四环素第124页/共136页杂质吸收度EATCATC.Anm、控制 50430异四环素控制 120530.Anm()注射用CTC