IgG存化与鉴定

1、实验二、免疫球蛋白igg的纯化与鉴定一、目的学习掌握免疫球蛋口 igg的提取、分离；理解离子交换层析的基本原理；并掌握川离 子交换层析分离纯化蛋口质的方法。二、实验原理以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是 同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分c通常川于制备酶标抗体或荧光 抗体的免疫球蛋口必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋口。因此，为了浓 缩和提髙抗体的效价，或为制备免疫球蛋口特界性抗体吋，通常也需要分离和纯化免疫球蛋 白。y球蛋白（igg）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%,因此， 抗体的分离纯化主要是分

2、离纯化igg。采用硫酸钱沉淀及层析、电泳等方法可提取纯化分析 免疫球蛋白iggo盐析一般是指溶液屮加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如：加浓（nil） 2so4 使蛋门质凝聚的过程。蛋门质在水溶液屮的溶解度是由蛋门质周用亲水基团与水形成水化膜 的程度，以及蛋口质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋口质溶液，小性盐对水 分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同吋，中性盐加 入蛋白质溶液后，市于离了强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解 度降低，使蛋口质分子之间聚集而沉淀。蛋白质盐析常川的屮性盐，主要有硫酸彼、硫酸镁、 硫酸钠、氯化钠、磷酸钠

3、等。其中应用最多的硫酸彼，它的优点是温度系数小而溶解度人 （209时饱和溶液为754克/升；0°c时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内, 许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸钱分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质 变性。透析（dialysis）是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与 生物人分了分开的一种分离纯化技术。蛋白质是人分了物质，不能透过透析膜而小分了物质 可以自由透过。层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换匍聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移 动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素、多糖等的一项技术。在纤维素与葡聚糖分子上 结合有一定

4、的离子基团，当结合阳离子基团时，对换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二 乙氨乙基（dicthylaminoethyl, deae）纤维素。在纤维素上结合了deae,含有带正电荷的阳 离子纤维素-o-c6h14n+h,它的反离子为阴离子（如ci-等），可与带负电荷的蛋口质阴离 子进行交换。当结合阴离子基团吋，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如竣甲基 （carboxymethy, cm）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素一och2coo 一），其反离子为阳离子（如na+等），可与带正电荷蛋口质阳离子进行交换。溶液的ph值与蛋 白质等电点相同时，静电荷为0,当溶液ph值人于蛋白质等电点时

5、，则竣基游离，蛋片质带 负电荷。反z,溶液的ph值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的 ph值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。在适当的盐浓度下，溶液的ph值高于等电 点时，蛋白质被阴离了交换剂所吸附；当溶液的ph值低于等电点时，蛋白质被阳离了交换 剂所吸附。由于各种蛋口质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液 ph值发工改变，就会总接影响到蛋口质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋口质逐个分 离开来。交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如naci）都具有交换吸附的能力，当两者同 时存在于一个层析过程中，则产牛竞争性的交换吸附。当q的浓度大时，蛋白质不

6、容易被 吸附，吸附后也易于被洗脱，当ci浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，在离子交换层析屮，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的 离子强度，-种是改变洗脱液的ph值。ph值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之対阳离子 交换剂的吸附力减弱。ph值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随z降低了蛋白质对阴离子交 换剂的吸附。当使用阴离了交换剂时，增加盐离了，则降低ph值。当使用阳离了交换剂时， 增加盐离子浓度，则升高溶液ph值。三、实验试剂和器材1. 抗原免疫动物血清，购丁兽医院的商用免疫血清2. 硫酸较饱和溶液硫酸彼800g-850g溶于loooml蒸饰水屮加热至绝大

7、部分溶质溶解为止，趁热过滤， 置室温过夜，然后以28%nh40h调ph至7.0 (不调ph值也可以)。3. 0.01 mol/l ph7.4磷酸盐缓冲液4. 0.01 mol/l (含0.05 mol/l氯化钠)ph7. 4磷酸盐缓冲液5. l%bac12 溶液6. deae-纤维素(de-52)7.5x蛋白上样缓冲液(10ml) 4度下保存：lmol/itirs-hci(ph&8)： 0.6ml；10%sds： 2ml50% 甘油：5ml2筑基乙醇：0.5ml1%漠酚兰：lml水：0.9ml另外：sds不好溶解建议加热溶解& 5 xtris-glycine buffer (s

8、ds-page 电泳缓冲液)1l：tris 15.lgglycine 94gsds 5.0g加入约800ml去离子水，搅拌溶解，加入去离子水将溶液定容至il9. 考马斯亮蓝染色液配制：称収1g考马斯亮蓝r-250,置于1l烧杯中。量取250ml 的异丙醇加入上述烧杯屮，搅拌溶解。加入100ml的冰乙醋酸，均匀搅拌。加入650ml 的去离子水，均匀搅拌。用滤纸出去颗粒物质后，宗温保存，可回收利用。组分：0.1% (w/v)考马斯亮蓝r-250, 25% (v/v)异丙醇,10% (v/v)冰醋酸10. 脱色液配制：1l体积：醋酸100ml,乙醇50ml, dh20 850ml ,充分混合后使 用

9、。组份浓度：10% (v/v)酷酸，5% (v/v)乙醇11. 蛋白分离胶与浓缩胶：不同浓度sdspage分离胶的最佳分离范围isds-pag旳海胶浓度最佳分斋范围1g£915.926.56.010.07.512.50.30.5uncn0.0240.04£co13.923.28.01337.512.50.30.50.30.589 o53.04.03.85.00.150.2cnlo i o0.012 0.016m&mocmojlnldooln6v<02.74.02.53.80.10.150.10.15oon usolhiojcxicir-j00s om9oiin

10、 ocooiioin ptemed0.004mzm lh mmooiioo1i30%acr-bis(29:l)1.5m tris,ph8.8 10%sds10%过硫帥g o00o cco2卜 ssci叫tto(si sooolavt-ho mocmcmio0 m o o o6 rh rh£-9t卜omooo6&oz f q i 卜 o(nm o oo0.012 (6 卜卜ocm9sool o oo9voocn00lho00cmoo c>g p6 usm081incnolaotooo6 寸m081k©coo9 m o i o c> o9s oovmstrn

11、rsi6tcocm rno in t-h04oi§o ocn o o6 fhin 卜mottogc6o9im omo0io(n m o o o oo* s3r! oo2 cow £to s人 s 人 co rh rhq 职 uj £ 运 o uji15%胶蒸馆水1.12.33.44.66.911.530%acr-bis(29:l)2.55.07.510.015.025.01.5m tris,ph8.81.32.53.85.07.512.510%sds0.050.10.150.20.30.510%过硫齣0.050.10.150.20.30.5temed0.0020.

12、0040.0060.0080.0120.02不同浓度sds-page浓缩胶的配制成分成分配制不同体枳sdspage浓缩胶所需各成分的体积（呈升）5%胶2346810蒸懾水1.42.12.74.15.56.830%acr-bis(29:l)0.330.50.671.01.31.7im tris, ph6.80.250.380.50.751.01.2510%sds0.020.030.040.060.080.110%过硫酸彼0.020.030.040.060.080.1temed0.0020.0030.0040.0060.0080.0112. 主要仪器和器材高速冷冻离心机，垂直电泳仪，透析袋，层析管

13、，紫外可见分光光度仪三、操作方法1.粗提取5 ml血清，加生理盐水5 ml,再逐滴加入（nh4） 2s04饱和溶液10ml, 边加边搅拌，充分混合后，此时，即有大量的y球蛋口沉淀（主要为1曲）置 冰箱过夜。冷冻离心（3000r/min, 15min）o再50%饱和度（nh.）2s0.溶液洗涤沉 淀2次。取沉淀加少量生理盐水溶解，装入透析袋中，用蒸懈水透析除盐（4°c 透析24h,中间换液数次）。透析外液用氯化锁测硫酸根离子或奈氏试剂测氨离 子（用l%bac12检查透析液屮的s0“2-或以奈氏试剂检查nh4+ （取3-4ml透析 液，加试剂12滴，出现砖红色即认为有nh4+存在）,直至

14、无s042-或nh4+出 现为止。透析后在透析袋内冇少量沉淀，可用离心除去，或者用半径为0. 44m 的滤膜过滤。2.准备deae纤维素（de52）层析柱（1）活化纤维素称取deae32或52,放入5ml量筒中，加蒸徭水浸泡过夜，观察溶胀后deae 的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需deae的用量，称取所需deae用蒸 憾水浸泡过夜，其间换儿次水，每次除去细小颗粒。用0.5mol/lnaoh溶液浸泡1h以上，用无离子水漂洗，使ph至8左右（用ph 试纸检杳）。改用0.5mol/lha溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离了水洗至ph6 左右。再用0.5mol/lnaoh溶液浸泡1h以上，用无

15、离子水漂洗，使ph至中性。用 0.01 mol/lph7.4磷酸盐缓冲液浸泡平衡1h以上。（2）装柱将层析柱清洗干净垂直同定到层析架上，加无离子水进行润洗，打开下出液 i-i,水流畅通，即可装柱。轻轻搅动将烧杯中已经预处理的deae-52纤维索溶液，使形成均一的薄胶浆， 并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的deae-52纤维素在柱内自然沉降，注意装 柱的速度要慢，装柱后，静置12h以上，静置过程中封闭出口，以免柱内液体流 干，最后形成的纤维素柱床体积为层析柱体积的一半，一定让柱内水而高于纤维 素柱床界面2cm左右。用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。如 果柱内水位下降超过纤维索的液面

16、，一般都会有干柱的可能，观察如果层析柱不 均一，必须重新装柱。（3）平衡在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱屮的溶液用 层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中 的系统一致。其方法是：打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-lml/min, 当下出口流出液的ph值与平衡缓冲液的ph值一致吋，层析柱达到了平衡。在木 实验中，用ph 7.40.01mol/l的i磷酸缓冲液预先将de52柱进行平衡。一般手动加 平衡液30min左右。3分离、纯化igg类取上述粗提的igg蛋白溶液，置0.01 mol/lph7.4磷酸盐缓冲液中透析平衡, 更换34次平

17、衡液。加入平衡后的的igg®白溶液。用0.01 mol/lph7.4磷酸盐 缓冲液(1个柱体积)洗出第一蛋白质峰，当0.01 mol/lph7.4磷酸盐缓冲液液 面下降到离柱床界面1-2cm处时，改用0.01 mol/lph7.4磷酸盐缓冲液一0.05 mol/lm化钠溶液(23个林体积)洗脱第二蛋白质峰。每次洗脱速度为0.2ml/mino 连续用2mlep管分步收集，测280nm处的吸光度值，给出洗脱曲线一。两蛋口质 峰均为igg,是不同的亚类。上样量为5mllfil清时，得igg约35mg.分步收集的 样甜包括，粗提的蛋白液，透析后的蛋白液，加入层析柱后流出的蛋白液，洗脱 过程中

18、流出的蛋白液。洗脱过程中流出的蛋白液在测定吸光度后，取吸光值较大 的蛋白液进行sdspage电泳检测，每个步骤都收集蛋白液进行检测时为了观察 蛋白存化的过程。交换柱的再生：对于用过的deae-52纤维索，可以重复利用多次，但需要经 过再生处理后才可以使用。再生处理可先用高浓度naci(l-2mol/l)过柱冲洗柱 床，以除去deae-52阴离子交换纤维所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/l的 hci和naoh处理，处理方法与预处理完全相同。保存：介质保存丁no%的乙醇 中，存放4°c,目的是防止介质滋生细菌。4lgg的纯度鉴定 sds-page凝胶电泳(1) 装好电泳板，加入蒸馆水，看是否漏水(2) 若不漏水，加入混合好的5 ml 6%分离胶溶液(加入分离胶后，分离胶 液面距胶板顶层3cm左右)，在分离胶上轻轻加入l2cm蒸憎水，放置30min；(3) 分