中药防治鸡汞中毒机理研究

1、中药防治鸡汞中毒机理研究（技术路线）1材料1.1试验动物及样品1.1.1汞矿周围采集的样品分别在汞矿区附近杨家湾，张家坪等村庄采集土壤、水；萝卜、玉米、大米和白菜等蔬菜各500g；当地农户笼养的鸡、鸭各3只，猪、牛、羊分别取一头，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉各500g。 1.1.2 试验性汞中毒动物试验动物为200只脱温鸡苗，购于贵阳市花溪区三桥某禽苗批发公司。检疫并观察一周后投入实验。1.2主要药物与试剂 中药：黄芪、甘草、茯苓、白茅根、白术、山药、蒲公英等购自贵州省贵阳市花溪区中医院汞标准储备液（100g/mL，国家标准物质中心）硝酸（优级纯，含量 65.0-68.0%，国药集团

2、化学试剂有限公司）30%过氧化氢（优级纯，天津市东方化工厂）氦气（青岛合利气体有限公司）二甲苯 (重庆川东化工（集团）有限公司)无水乙醇 (重庆川东化工（集团）有限公司)苏木素 (武汉博士德生物工程公司)多聚甲醛 (天津市同鑫化工厂)中性树胶 (中杉金桥生物公司)石蜡 (熔点：57-61，上海标本模型厂)SOD 超氧化物歧化酶（鼎国生物技术有限责任公司)GSH-PX 谷胱甘肽过氧化物酶（鼎国生物技术有限责任公司)MDA 丙二醛（鼎国生物技术有限责任公司)AST 谷草转氨酶（鼎国生物技术有限责任公司)1.3主要试验器材SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 (苏州净化设备有限公司)PE-6800V

3、ET全自动血细胞分析仪（深圳市普康电子有限公司）TGL-20M台式冷冻离心机（长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司）Scanspeed微型台式离心机（丹麦Labogene公司）BS110S电子天平（德国SARTORIUS ）Leica RM2125切片机（德国徕卡公司）MDF-382E -80低温冰箱（SANYO公司）BCD-215KC F海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）OLYMPUS CH20BIMF200显微镜（日本OLYMPUS 光学有限公司）PHS-3S酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）微波消解萃取仪 (上海新仪微波化学科技有限公司)ECH-1型电子控温加热板 (上海新仪微波化学科技有限公司)

4、LD4-2A离心机（北京医用离心机厂）AFS-9130 双道原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）Sartorius 电子天平（德国赛多利斯公司）ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometry)（北京吉天）2方法2.1汞矿周围环境及畜禽体内汞含量调查2.1.1样品采集与处理2.1.1.1土壤采集与处理采集：土壤采用4分法则采集，每个样品从5m x 5m的正方形4个顶点和中心点共5处各采集1kg的表层土壤（0-20cm），均匀混合后用4分法从中选取1kg土壤，代表该点的混合样品。样品用聚乙烯塑料袋编号封装保存，防止交叉

5、污染。处理：样品带回实验室后，除去所采样品中石子，植物及其它杂质，充分风干后取部分样品，研钵捣碎研磨，过100目尼龙筛，在40烘箱中干燥24 h后干燥器皿中保存备用；将土壤样品1.0g置于250ml锥形瓶中，用少量蒸馏水润湿，加入硫酸-硝酸混合液10.0mL，待剧烈反应停止后，加入去离子水15mL，在瓶口插一玻璃漏斗，置于水浴锅中加热至80，保持60min，同时做空白对照。待加热完成后，降至室温，将试液（含残渣）全部移入100mL容量瓶中，用去离子水洗涤锥形瓶3-5次，洗涤液并入容量瓶，加去离子水至标线，摇匀，待测。2.1.1.2 水体采集与处理采集：采用孔径为0.04um醋酸纤微滤膜现场对水

6、样进行过滤，过滤水样装入500mL经预先处理的超净聚乙烯瓶保存。在采集样品之前所使用的所有器皿必须先用样品水洗涤，润洗，至少3次后再将样品水装入瓶中。采样操作过程中均使用一次性聚乙烯手套，尽可能减少操作过程中带入的人为汞污染。处理：带回实验室后加5.0mL12mol/L HCl，置于0-4保存，待测。2.1.1.3 动物样品及农作物的采集与处理采集：选择矿区附近农田中水稻（去壳，取其中大米）、玉米（去外包叶和玉米棒，取其中玉米粒）和蔬菜（带回实验室后先用高纯水冲洗表面，在100级洁净工作台里室温下进行干燥），然后密封于3层聚乙烯样品袋中，编号，冷冻保存直到分析；鸡、鸭、猪、牛、羊分别采集肝脏、

7、心脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉等分装入预先处理的聚乙烯袋中，分别标记，-20保存。处理：将已标记的动物样品及农作物分别磨碎，称取约0.2g（准确至0.0001g）经磨碎的样品，置于耐高温压力消解罐底部，加入5mL浓硝酸（分析纯），3mL过氧化氢（分析纯），摇匀，将消解罐密封后置于高温高压微波消解仪中消解。消解结束后，移出消解仪，待消解罐完全冷却后再开启。将消解罐中的消解液全部移至50mL的容量瓶中，用蒸馏水仔细冲洗罐盖及罐壁，将洗液混入容量瓶里的消解液中，最后用蒸馏水定容至刻度，混匀，待测。试验中所有玻璃器皿均以20%硝酸溶液浸泡24h，用纯水反复冲洗，最后用超纯水冲洗晾干后，方可使用。2.1.

8、2汞含量测定方法所有样本中汞（Hg）的检测均参照 GB/T 5009.17-2003原子荧光光谱法计进行测定。空白对照除不加入待测试样外，其他均按上述步骤操作。2.1.2.1原子荧光光度法测定原理和步骤测定原理：原子荧光是原子蒸汽受到具有特征波长光源照射后，其中一些自由原子被激发跃迁到较高能态，然后跃迁回到某一较低能态（常是基态）而发射出特征光谱的物理现象。当激发辐射的波长与产生荧光的波长相同时，称为共振荧光，它是原子荧光分析中最主要的分析线。另外还有直跃线荧光、阶跃线荧光、敏化荧光、阶跃激发荧光等。各种元素都有其特定的原子荧光光谱，根据原子荧光强度的高低可测定试样中待测元素的含量。测定步骤：

9、(1) 开机准备实验室应保持在温度 1530，湿度 45%70%之间：开启排风机，使室内保持通风状态。打开原子化器室前门，检查气液分离器中水封，需要及时加水；检查蠕动泵及压块，确保各泵管无泄漏，泵管与压块间足够润滑，否则滴加适量润滑油。检察元素灯，确定为待测元素灯，否则更换。更换元素灯时，一定要在主机电源关闭的情况下进行，不得带电拔插。开启载气钢瓶减压阀，使次级阀压力小于0.3MPa，控制在0.25MPa- 0.28 MPa范围内。(2) 操作运行接通电源，顺序开启电脑、原子荧光光度计主机电源。检察元素灯光斑是否聚焦于中心位置，否则将调光器放在石英原子化炉上，按照正确方法调节元素灯至聚焦。点击

10、电脑桌面上的“AFS-9130 原子荧光光度计”图标，运行操作软件，仪器自检。在“元素表”菜单进行元素灯的识别与选择后，单击“确定”退出对话框。点击“点火”点燃原子化炉，预热30min。将载流、标准空白、标准样品系列、样品空白、管理样品、未知样品溶液等配置完毕后，按照一定顺序放置在自动进样器的样品盘内。根据分析方法的需要，对“仪器条件”，“标准系列”和“样品参数”等内容进行相关参数的设置。然后点测量。测量完毕后，将载流液和还原液换成蒸馏水，点击“清洗程序”，对管道行两次清洗。所有操作完成后，点击“熄火”，将原子化炉熄灭后，退出软件，关闭原子荧光光度计主机电源及电脑，打开蠕动泵压块，放松泵管。2

11、.1.2.2结果计算按式（1）计算试样中待测元素的含量：Xi=(Ci- Cio)×v/m×100（1）式中：Xi：试样中元素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；Ci：从标准曲线上查得试样溶液中各被测元素的浓度，单位为微克每升（g/L）；Cio：从标准曲线上查得空白溶液中被测元素的浓度，单位为微克每升（g/L）；V：测试溶液的体积，单位为毫升（mL）；m：试样的质量，单位为克（g）。2.2中药防治鸡汞中毒的试验研究2.2.1汞致试验鸡半数致死量LD50的测定 （1）致死量的确定按汞的国家标准值（Hg0.05mg/kg）的6000倍剂量：(300mg/kg)给药，观察4h，

12、筛选出致死剂量。（2）半数致死量的确定以致死剂量开始，往下按0.7倍的递减剂量分组，相邻两个剂量的对数之差相同。实验先从大剂量开始，于第一只动物用药后，如果发生死亡，在表中以“f”记录，下一只动物就降低一级剂量给药；相反，如果动物存活，下一只动物就用高一级剂量。依此类推。最后一只动物，虽未进行实验，但在表格内仍占位置，以符号表示。一般以出现不死剂量的向前于第2个死亡剂量为起始剂量，于第一次出现不死剂量为中心剂量。根据LD50公式（ LD50 =lg-1 C/n( mg/kg)）计算出半数致死量2.2.2实验性鸡汞中毒最佳剂量筛选从购买的健康鸡苗中，选取体重均匀的32只，随机分为4组，每组8只，

13、分为4组： 1/16 LD50、1/8 LD50、1/4 LD50、1/2 LD50、空白对照组仅喂基础日料，自由饮用自来水；实验组喂（基础日粮+1/16 LD50）、（基础日粮+1/8 LD50）、（基础日粮+1/4 LD50）、（基础日粮+1/2 LD50），自由饮自来水。观察临床表现，实验期共计15天。于第15d后，宰杀实验鸡，采集血液，检测血清中生化指标；取其肝脏、肾脏、脾脏观察病理学变化。2.2.3中药最适剂量筛选2.2.3.1 中药制备把准备好的中药饮片装入粉碎机进行粉碎，然后过100目筛，以“阶梯分配法”，均匀的混在饲料中，备用。2.2.3.2中药剂量筛选从购买的健康鸡苗中，选取

14、体重均匀的32只，随机分为4组，每组8只，分别为每天2g中药/只、每天4g中药/只、每天6g中药/只、每天8g中药/只、空白对照组仅喂基础日料，自由饮用自来水；实验组分别喂（基础日粮+2g中药+36mg/kg HgCl2）、(基础日粮+4g中药+36mg/kg HgCl2)、(基础日+6g中药+36mg/kg HgCl2)、(基础日粮+8g中药+36mg/kg HgCl2），饮用自来水。观察临床表现，实验期共计15天。15d后，宰杀实验鸡，采集血液，检测血清中生化指标；取其肝脏、肾脏、脾脏观察脏器指数变化。2.2.4防治试验动物分组与处理从购买的200只脱温鸡苗中选出健康、体重大小与个体差异均

15、衡的鸡苗72只，随机均分为3组，每组24只，分别设空白对照组，阳性对照组和中药治疗组。空白对照组饲仅喂基础日粮；阳性对照组喂(基础日粮+36mg/kgHgCl2 )；中药治疗组喂(基础基日粮+6g中药+36mg/kgHgCl2 )，各组自由饮用自来水，分笼常规饲养，试验期共计60d，试验期内观察试验鸡的临床表现。 2.2.5防治试验样品采集与处理试验于第20d、40d、60d时，分别禁食12h，每组随机选取8只鸡称重，采用颈动脉采血法采集血液，将血液分别装入无添加剂与有添加剂的采血管，并作记录。无添加剂管在室温下静置30分钟，2000-3000转/分离心30分钟，收集上清液并分装后置-80保存

16、，用于SOD、GSH-PX、AST及MDA的测定；有添加管血液采集后，在6h内进行血细胞成分分析。采血后，鸡只颈总动脉放血处死，分离肝、脾、肾等脏器，剔除脏器表面的脂肪和筋膜，用滤纸吸净表面的血液后（心脏处理：在大血管出入处剪断血管，用滤纸吸取心脏内残血），电子天平称量各脏器重量（左右肾合并称重）。脏器称重后，取5mm×5mm×3mm的肾脏、肝脏等组织块置于10%福尔马林磷酸盐缓冲液中固定。剩余组织器官分别装入已编号的聚乙烯塑料袋中，置于-20保存测定汞含量。2.2.6汞对试验鸡部分脏器指数的影响取实验动物肝脏、脾脏、肾脏，并称重，记录。用下式进行计算：脏器系数=脏器重（g

17、）/体重（g）2.2.7病理组织学切片制作(1)取材及固定：将取出的组织固定于中性福尔马林中，时间为3d。(2)切片制作：取出在中性福尔马林中固定好的组织冲水过夜（12h以上）经70%、80%、95%、95%、100%梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，5微米连续切片，37水浴中展片，将展好的蜡带粘附与载玻片上，制成切片。(3)HE染色步骤：将制好的切片，置于58恒温箱中烤片4-6h后，于二甲苯中脱蜡，经 100%、95%、85%、75%酒精逐级脱蜡后，置于纯水中3-5 min后经苏木素染色5min,水洗，用1%盐酸乙醇分化2-3s，1%氨水返蓝2-3s，水洗，伊红染色2min，水洗

18、，再经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片，最后置于光学显微镜下观察，并拍照2.2.8血细胞成分分析采血后6h内用血细胞成分分析仪检测各组鸡只血样中白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、中间细胞(MID)、粒细胞(GRAN)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞分布宽度SD(RDW-SD)、红细胞分布宽度CV(RDW-CV)、红细胞压积(HCT)、平均血红蛋白含量(M CH)和平均血红蛋白浓度(MCHC)等指标2.2.9氧化还原相关指标检测细胞因子SOD、GSH-PX、AST及MDA的测定均用酶联免疫分析（ELISA）法。按试剂盒操作方法进行，具体操作步骤

19、如下：（1）标准品的稀释与加样：在酶标包装板上设标准品空10孔，于第一、于第二孔分别加标准品100ul，然后在于第一、于第二孔加标准品稀释液50ul，混匀；然后从于第一、于第二孔各取100ul分别加到于第三孔和于第四孔，再在于第三、于第四孔分别加标准品稀释液50ul，混匀；然后在于第三孔和于第四孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加到于第五、于第六孔中，再在于第五、于第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从于第五、于第六孔中各取50ul分别加到于第七、于第八孔中，再在于第七、于第八孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从于第七、于第八孔中各取50ul分别加到于第九、于第十

20、孔中，再在于第九、于第十孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从于第九、于第十孔中各取50ul弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，GSH-PX浓度分别为600U/L，400 U/L ，200 U/L，100 U/L，50 U/L；AST浓度分别为24U/L，16U/L ，8U/L，4U/L， 2U/L；SOD浓度分别为150U/L，100U/L ，50U/L，25U/L， 12.5U/L；MDA浓度分别为6mmol/L，4mmol/L ，2mmol/L，1mmol/L， 0.5mmol/L）（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测