分离工程复习资料整理版

1、1、 生物分离过程的特点：生物物质的活性，遇高温，pH变化，化学药物时不稳定，料液中常有讲解目标产物的物质（酶），设计合理的分离过程和操作条件，快速分离纯化得到高活性的目标产物。与人类生命相关的产物，应除去对人类有害的物质，并防止其从外界混入。存在于目标产物相似的分子或异构体，采用多种分离方法或多个分离步骤。整个过程的总回收率YT=Y1+Y2+.Yi回收率低，成本大提高回收率：提高每一步的回收率，减少步骤原料液中目标产物浓度低，需要进行高浓度浓缩，成本高。2、 生物分离技术和原理物理性质：力学性质（密度、尺寸、形状） 热力学性质（溶解度、挥发度、表面活性、相间分配平衡） 传质性质（粘度、扩散系

2、数） 电磁性质（电荷特性、电荷分布、等电点、磁性）化学性质：化学平衡、反应速率、激光激发作用生物学性质：利用分子识别作用、利用酶反应的立体选择性3、对于特定的分离方法或分离设备，评价指标包括 分离容量capacity：单位体积的分离设备处理料液或目标产物的体积或质量。 分离速度speed：单批次分离所需的时间，或连续分离过程的进料速度。 分辨率resolution：目标产品的纯化效果或杂志的去除能力。4、重力沉降 球形固体颗粒的匀速沉降速度为Vg=dp2（S -L）g / 18L5、如何提高重力沉降？ 在中性盐的作用下，可使菌体表面双电层排斥电位降低，利于菌体之间产生凝聚。 向菌体的料液中加入

3、高分子絮凝剂，可使菌体之间产生架桥作用而形成较大的凝聚颗粒。凝聚或絮凝有利于重力沉降，还可以提高过滤速度和质量。培养液中含有蛋白质时，可使部分蛋白质凝聚而同时过滤除去。6、单位质量的物质所受到的离心力为Fc=r27、差速离心differential centrifugation以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为以及分级分离。菌体和细胞一般在500-5000g的离心力下就可以完全沉降。8、区带离心zonal centrifugation：差速区带离心、平衡区带离心需要事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度上加待处理的料液进行离心分离操作

4、。用于蛋白质、核算等生物大分子，处理量小，仅限于实验室水平。区别：差速（密度梯度中的最大密度小于待分离的目标产物的密度）平衡（密度梯度比差速的密度梯度高）9、过滤filtration：利用薄片形多孔性介质节流固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。10、过滤速度：透过速度dQ/dt=Ap/L（Rm+Rc） A过滤面积 p操作压力 Q滤液体积 L滤液粘度 Rm、Rc介质和滤饼的阻力 滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，如何提高过滤速度？ 对滤液进行絮凝或凝聚等预处理，降低滤饼的阻力。 在料液中加入助滤剂，但以菌体细胞为收集目的时，会给之后的操作带来麻烦。11、细胞破碎主要采用机械破碎法mech

5、anical disruption和化学破碎法chemical disruption（又称化学渗透chemical permeation），或二者结合。12、高压匀浆，又称高压剪切破碎，其机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀左键的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放在低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。13、 超声波破碎的机理：在超声波的作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。14、 化学和生物化学渗透酸碱处理：利用酸碱调节pH值，提高目标产物溶解度。化学试剂处理：用表面活性剂或有机溶剂处理细胞，可增大细胞壁

6、通透性。变性剂能破坏氢键作用，降低胞内产物之间的相互作用，使之容易释放。酶溶：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。15、 目标产物的选择性释放原则：仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围：当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用比较温和的方式。当目标产物存在于细胞质内时，需采用强烈的机械破碎法。选择性溶解目标产物：当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液pH值、离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂，使目标产物容易溶解释放，溶液性质应使其他杂质不易溶出。机械法和化学法并用可使操作条件更温和，在相同的目

7、标产物释放率的情况下，降低细胞的破碎程度。16、 沉淀precipitation是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。17、 蛋白质为什么能稳定存在？蛋白质周围的水化层和双电层。可以通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。18、 防止沉淀的方法：19、 Cohn经验方程 lgS=- KsI S蛋白质的溶解度；常数；Ks盐析常数；I离子强度 I=1/2 ciZi2 ci 离子i的浓度；Zi电荷数影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度、pH值。一般物质的溶解度随温度升高而增大，但在离子强度较高的溶液中，升高温度有利于某些蛋白

8、质的失水，因而温度升高，蛋白质的溶解度下降。在pH值结晶蛋白质等电点的溶液中，蛋白质的溶解度最小（值最小），所以调节溶液pH在等电点附近最利于提高盐析效果。20、 影响盐析的因素：反映在方程中就是对和Ks的影响，不同蛋白质的值不同，Ks值随蛋白质相对分子质量的增大或分子不对称性的增强而增大，即结构不对称、相对分子质量大的蛋白质易于盐析沉淀。影响因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。21、 （书31页）在20下，硫酸铵的饱和浓度约为4.05,mol/L（534g/L），硫酸铵的浓度从M1增大到M2所需加入的硫酸铵量为W=534（M2-M1）/（4.05-0.3M2）在0下，饱和硫酸铵溶液浓度为

9、3.825mol/L（505g/L），W=505（M2-M1）/（3.825-0.285M2）22、 等电点沉淀isoelectric precipitation 利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法。23、 有机溶剂沉淀（破坏其水化层）：向蛋白质溶液中加入病痛或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低。24、 水溶性胶团 micelles25、 表面活性剂在水溶液中形成胶团的最低浓度称为临界胶团浓度 critical micelle concentration CMC26、 膜分离 membrane separation 是利用具有一定选择透过性的过滤介质进行物

10、质的分离纯化。27、 膜分离法包括微滤（microfiltration）超滤（ultrafiltration）反渗透（reverse osmosis）透析（dialysis）电渗析（electrodialysis）渗透气化（pervaporation）28、 渗透：若膜两侧压力相同，在浓差的作用下作为溶剂的水分子从介质浓度低（水浓度高）的一侧（A侧，纯水）向溶质浓度高的一侧（B侧，水溶液）透过。29、 反渗透：如果欲使B侧溶液中的溶剂（水）渗透到A侧，在B侧所施加的压力必须大于此渗透压。30、 Fick第一定律：在单位时间内通过垂直于扩散方向的单位面积的扩散物质流量（扩散通量），与流截面处的浓

11、度梯度成正比。 J=-D dc/dx根据Fick定律，摩尔通量N2=-2 ·2/l D2溶质在膜中的扩散系数31、 超滤：根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。32、 透析：利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液与纯水或缓冲液（称为透析液）分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质（如无机盐）透向透析液，透析液中的水则透向高分子溶液。33、 电渗析原理：利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质的分离和溶液的脱盐。（右图） 34、 在膜表面

12、附近浓度高于主体浓度的现象，称为浓度极化或浓差极化concentration polarization35、 当分离含有菌体、细胞或其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层，称为凝胶极化 gel polarization36、 一般将在截留曲线上截留率为0.90（90%）的溶质的相对分子质量定义为膜的截留相对分子质量 molecular mass cut-off MMCO37、 萃取extraction 利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。38、 反萃取back extraction 调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。39、 分配定律，即溶质的分配

13、平衡规律：在恒温恒压条件下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，如果其在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为常数，称为分配常数，A。 A=c2/c140、 分配系数（分配比）m=c2，t/c1，t c2，t c1，t为溶质在相1和相2中的总浓度 m=yt/xt yt xt为在溶质的总摩尔分数 m为分配系数41、 溶剂萃取操作水相物理条件的影响：水相pH值对弱电解质分配系数均具有显著影响。物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH值降低而增大，而弱碱性电解质则正相反。温度也是影响分配系数和萃取速率的重要因素。选择适当的操作温度，有利于目标产物的回收和纯化。操作一般在常温或较低温

14、度下进行。无机盐的存在可降低溶质在水相中得溶解度，有利于溶质向有机相中分配。有机溶剂或稀释剂的选择：根据相似相溶的原理，选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大分配系数。有机溶剂需满足要求：1、价廉易得；2、与水相不互溶；3、与水相有较大的密度差，黏度小，表面张力适中，容易相分离和相分散；4、容易回收和再利用；5、毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全；6、不与目标产物反应。化学萃取剂：由于氨基酸和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，需采用化学萃取。乳化现象：乳化即水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。产生乳

15、化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带：1、发酵废液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失；2、有机溶剂中夹带发酵废液，给后处理操作带来困难。产生乳化现象的主要原因是发酵液中存在蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活性剂的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。42、 E=mL/H H、L分别为料液和萃取剂的流量或添加量（书75页）43、 双水相系统aqueous two-phase extraction 一些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，形成双水相系统。44、 （书85页）曲线称为双结点线，双

16、结点线以下为均相区，以上为两相区。连接双结点线上两点的直线为系线（tie line）。当系线长度趋于零时，在图中双结点线上的K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点（critical point）。45、 双水相中的分配平衡用c1、c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度（mol/L），则m=c2/c1。生物分子的分配系数取决于溶质和双水相系统间的相互作用，主要有静电作用、疏水作用、生物亲合作用。分配系数是各种相互作用的和。lnm = lnme + lnmh + lnml me mh ml 分别表示静电作用、疏水作用和生物亲合作用对溶质分配系数的贡献。影响

17、平衡的因素：静电作用、疏水作用46、 乳状液膜根据成膜液体的不同，分为（W/O）/W（水-油-水）和（O/W）/O（油-水-油）两种，生物分离中主要应用水-油-水型乳状液膜。47、 液膜萃取机理：单纯迁移反萃取相化学反应促进迁移膜相载体运输48、 反向迁移：供能物质与目标溶质迁移方向相反49、 同向迁移：供能物质与目标溶质迁移方向相同50、 反胶团萃取reversed micellar extraction利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团，从而在有机相中形成分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了生物分子，特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解在有机相

18、中或在有机相中发生不可逆变性的现象。51、 反胶团的溶解作用（书104页）静电相互作用空间相互作用52、 （书112-113页）超临界流体萃取SCF extraction 利用超临界流体为萃取剂的萃取操作。53、 影响物质在超临界流体中溶解度的主要因素为温度和压力。54、 吸附adsorption是溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附剂adsorbent55、 吸附剂对溶质的吸附作用按吸附作用力区分主要有三类，即物理吸附、化学吸附和离子交换。56、 离子交换剂分阳离子交换剂（cation exchanger）和阴离子交换剂（anion exchanger）。前者对阳离子具有交换能力，活性基团

19、为酸性，后者对阴离子具有交换能力，活性基团为碱性。57、 离子交换基团：强酸性基：磺酸基、磺丙基、膦酸基弱酸性基：羧甲基、羧基强碱性基：三甲氨基、二甲基-羟基乙胺、季氨乙基、三乙胺乙基弱碱性基：二乙氨乙基、二乙氨基、氨基58、 扩散系数D用Fick定律定义：JA=- D dcA/dxJA溶质A的扩散通量；cA溶质的浓度；x扩散方向上的距离；D扩散系数；dcA/dx溶质在扩散方向上的浓度梯度。59、 出口处溶质浓度开始上升的点称为穿透点。达到穿透点所用的操作时间称为穿越时间。（右图）60、 色谱原理：色谱分离的主体介质由互不相溶的流动相（mobile phase）和固定相（stationary

20、phase）组成。色谱就是根据混合物中的溶质在两相之间分配行为的差别引起的随流动相移动速度的不同进行分离的方法。分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动的速度小。61、 色谱分类：根据流动相的相态：气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法固定相：固体、液体、以固体为载体的液体薄层生物分离主要采用液相色谱法。根据固定相或色谱装置形状的不同：液相色谱：纸色谱、薄层色谱、柱色谱纸色谱和柱色谱多用于分析目的；柱色谱适用于大量制备分离。根据操作压力：低压、中压、高压液相色谱大规模制备分离最常用低压和中压。轴向流色谱、径向流色谱：相同处理量条件下，大规模径向流色谱可或得比轴向流色谱更高的柱效率

21、。因此更适合大规模分离过程。根据操作方式不同：洗脱展开、迎头分析、置换展开（洗脱色谱）置换展开适合大量处理稀溶液，是最常见的色谱分析法。60、 F=（1-c）/c可得色谱柱内不同浓度的溶质从柱内流出所需的洗脱时间。61、 tR=（1+mF） VR=V0（1+mF） VR=V0+m（Vt-V0） 线性分配平衡情况下洗脱峰的洗脱时间或体积计算公式对于优惠吸附，因为f(cm)随cm增大而减小，则溶质浓度越高，洗脱时间越短，所以洗脱峰前部出现激波层，而后部明显拖尾。62、 理论板模型HETP=L/N 理论版当量高度HETP63、 N=16（R/W）2 R 平均洗脱时间 W 底线处切线宽度64、 HET

22、P=A/u+B+Cu ABC是与u无关的常数 u流速65、 分离度（分辨率）resolution 表达两个洗脱位置相邻的溶质相互分离的程度Rs=2（R2-R1）/（W1+W2）假定洗脱曲线为Gauss分布，分配平衡关系为线性，并且利用两种溶质测得的理论板数相等，Rs=F（m2-m1）N1/2/2(2+m1F+m2F)66、 凝胶过滤色谱GFC是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。67、 VR,B - VR,A = (Vt - V0)(mB - mA) VR,B VR,A 分别为溶质AB的洗脱体积68、 凝胶特性参数：排阻极限分级范围凝胶粒径空隙体积溶胀率

23、床体积69、 影响分离的因素：线速度料液体积料液浓度相对分子质量与分配系数的关系凝胶粒径70、 凝胶过滤色谱的应用：分离纯化：GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化脱盐：GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分子质量物质。相对分子质量的测定：用于未知物质的相对分子质量测定。71、 离子交换色谱IEC是利用离子交换剂为固定相，根据荷店溶质于离子交换剂之间经典相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。72、 线性梯度洗脱法：优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广。缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。73、 逐次洗脱法：优

24、点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便。缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰，此外容易出现多组分洗脱峰重叠现象，因此洗脱操作参数的设计比较困难。74、 实际色谱操作中，若料液组成为止，一般首选线性梯度洗脱法，确定各种组分的分配特色以及色谱操作的条件。75、 疏水相互作用色谱HIC原理：利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。76、 反相色谱RPLC：利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离

25、纯化的洗脱色谱法。77、 亲和作用：指生物分子间的特异性结合作用。78、 亲和作用包括静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键。79、 亲和色谱的固定相是键合亲和配给的亲和吸附介质。由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度的选择性。80、 亲和色谱的操作分进料，杂质清洗，目标产物洗脱，色谱柱再生。81、 包含体 inclusion body 重组蛋白质的高表达常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集，形成被称为包含体的聚集体。82、 复性 renaturation83、 结晶 cystallization84、 结晶与沉淀的区别：结晶（形状一定的固体粒子，有规则排列的晶体）沉淀（无规则排列的、不定型的固体颗粒，夹杂共存的杂质盐和溶剂，纯度低于结晶）85、 包和浓度 saturated concentrati