发酵工艺控制——氧对发酵的影响及控制

1、发酵工艺控制氧对发酵的影响及控制 在好氧深层培养屮，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。通气效率的改进 可减少空气的使用量，从而减少泡沫的形成和杂菌污染的机会。一、溶解氧对发酵的影响溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水屮的溶解度很小，在发酵液屮的溶 解度亦如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的人小 对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸 积累就会明显降低，产牛大量乳酸和琥珀酸。需氧发酵并不是溶氧愈人愈好。溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太人 冇时反而抑制产物的形成。因为，为避免发酵处于限氧

2、条件下，需要考查每一种发酵产物的 临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。最适溶氧浓度的大小为菌体和产 物合成代谢的特性冇关，这是由实验來确定的。根据发酵需氧要求不同可分为三类：笫一类 有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下, 产量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就会受到强烈的抑制，大量积累乳酸和琥珀酸；第 二类，包括异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得蝕 高产最，但供氧受限，产最受影响并不明显；第三类，有亮氨酸、缄氨酸和苯丙氨酸，仅在 供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成

3、反而受 到抑制。氨基酸合成的需氧程度产生上述差别的原因，是由它们的生物合成途径不同所引起的, 不同的代谢途径产生不同数虽的nad(p)h,当然再氧化所盂要的溶氧量也不同。第一类氨 -基酸是经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式内酮酸竣化系统两个途径形成的，产生的nadh虽:最 多。因此nadh氧化再生的需氧量为最多，供氧愈多，合成氨基酸当然亦愈顺利。笫二类 的合成途径是产生nadh的乙醛酸循坏或消耗nadh的磷酸烯醇式丙酮酸竣化系统，产生 的nadh呆不多，因而与供氧呆关系不明显。第三类，如苯丙氨酸的合成，并不经tca循 环，nadh产量很少，过量供氧，反而起到抑制作用。肌卄发酵也有类似的结果。由此可 知

4、，供氧大小是少产物的生物合成途径有关0在抗牛索发酵过程屮，菌体的牛长阶段和产物合成阶段都有一个临界氧浓度，分别为c 临'和c临。两者的关系有：大致相同；c临'>c临c临'<c临"。二、微生物对氧的需求好氧微纶物生长和代谢均需要氧气，因此供氧必须满足微生物在不同阶段的需要，在不 同的环境条件下，各种不同的微生物的吸氧量或呼吸强度是不同的。微牛物的吸氧量帘川呼吸强度和摄氧率两种方法來表示，呼吸强度是指单位质量的干菌休在 单位时间内所吸収的氧量，以qo2,表示，单位为mmolo2 / (g t菌体h)。当氧成为限制 性条件时，比耗氧速率为：qo2=(qo

5、2)mcl/ (ko+cl)(q02)m最大比耗氧速度,mol /(kg.s)k0氧的米氏常数,mol /m3cl 溶解氧的浓度，mol/m3摄氧率是指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，以r表示，单位为mmo!02/(l-h)o呼 吸强度可以表示微生物的相对吸氧量，但是，当培养液屮有固体成分存在时，对测定有困难, 这时可用摄氧率來表示。微牛:物在发酵过程中的摄氧率取决于微生物的呼吸强度和单位体积 菌休浓度。微生物的比耗氧速率的大小受多种因索影响，当培养基中不存在其他限制性基质时，比耗氧 速率随溶氧浓度增加而增加，肓至某一点，比耗氧速率不再随溶氧浓度的增加而增加，此时 的溶氧浓度称为呼吸临界氧

6、浓度(criticaloxygenconcentrationof respiration),以ccr表示。呼 吸临界溶氧浓度一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，如对产物形成1何言便称为产物 合成的呼吸临界氧浓度。当不存在其他限制性基质时，溶解氧浓度高于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；在 临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降，细胞处于半厌气状态, 代谢活动受到肌碍。培养液中维持微牛物呼吸和代谢所需的氧保持供氧与耗氧的平衡，才能 满足微牛物对氧的利用。由此可知，只有使溶氧浓度人于其临界氧浓度时，才能维持菌体的最人的比耗氧速率，以使 菌体得到最大的合成虽。但由于发酵的冃的

7、是为了得到发酵的产物，因此，由氧饥饿而引起 的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的。所以，需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。即 使是一些专性好氧菌，过高的溶氧对生长可能不利。氧的冇害作用是通过形成新生0,超氧 化物基02和过氧化物基022或為基自由基oh，破坏许多细胞纽分体现的。有些带筑基 的酶对高浓度的氧敏感，好气微乞物曾发展一些机制，如形成触酶，过氧化物酶和超氧化物 歧化酶，使其免遭氧的摧毁。溶氧高虽然冇利于菌体生氏和产物合成，溶氧太大冇时反而抑 制产物的形成。为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适 氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。最适浓度的大小与菌体和产物合

8、成代谢的特性有关, 这是由实验来确定的。发酵生产中，供氧的多少应根据不同的菌种、发酵条件和发酵阶段等 具体情况决定。例如谷氨酸发酵在菌体生反期，希望糖的消耗最大限度地用于合成菌体，而在谷氨酸生 成期，则希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸。因此，在菌体生长期，供氧必须满足菌 体呼吸的需氧量，即r=qo2c(x),若菌体的需氧量得不到满足，则菌体呼吸受到抑制，而抑 制生长，引起乳酸等副产物的积累，菌体收率降低。但是供氧并非越大越好，当供氧满足菌 体需要，菌体的生长速率达最人值，如果再提高供氧，不但不能促进生长，造成浪费，而且 由于高氧水平抑制牛长。同时高氧水平下牛长的菌体不能有效地产牛谷氨酸。三

9、、影响微生物需氧量的因素在需氧微生物发酵过程中影响微生物需氧量的因素很多，除了和菌体本身的遗转特性冇 关外，还和卜列一些因素有关：1 培养基培养基的成分和浓度对产生菌的需氧虽的影响是显著的。培养基中碳源的种类和浓度对微生 物的需氧最的彩响尤其显著。一般来说，碳源在一定范围内，需氧最随確源浓度的增加而增 加。在补料分批发酵过程中，菌种的需氧量随补入的碳源浓度而变化，一般补料后，摄氧率 均呈现不同程度的增大。2、菌龄及细胞浓度不同的生产菌种，其盂氧量各异。同一菌种的不同生氏阶段，英需氧虽也不同。一般说, 菌体处于对数生长阶段的呼吸强度较高，生长阶段的摄氧率大于产物合成期的摄氧率。在分 批发酵过程中

10、，摄氧率在对数期后期达到最大值。因此认为培养液的摄氧率达最高时，表明 培养液中菌体浓度达到了最大值。3、培养液屮溶解氧浓度的彩响在发酵过程小，培养液屮的溶解氧浓度(cl)高于菌体生长的临界氧浓度(c长临)时，菌体的 呼吸就不受影响，菌体的各种代谢活动不受干扰；如果培养液中的cl低于c长临吋，菌体 的多种生化代谢就要受到影响，严垂时会产生不可逆的抑制菌体生长和产物合成的现彖。4、培养条件若干实验表明，微生物呼吸强度的临界值除受到培养棊组成的影响外，还与培养液的ph、 温度等培养条件相关。一般说，温度愈高，营养成分愈丰富，其呼吸强度的临界值也相应增 高。5、有毒产物的形成及积累在发酵过程屮，有时会

11、产生一些对菌体生长有毒性的如co2等代谢产物，如不能及时 从培养液中排除，势必影响菌体的呼吸，进而影响菌体的代谢活动。6、挥发性中i'可产物的损失在糖代谢过程中，有时会产生一些挥发性的有机酸，它们随着大量通气而损失，从而影响菌 休的呼吸代谢。四、氧在发酵液屮的传递1、氧的传递阻力在需氧发酵过程中，气态氧必须先溶解于培养基中，然后才可能传递至细胞表面,再经过简 单的扩散作用进入细胞内的呼吸酶的位置上而被利用，参与菌体内的氧化等生物化学反应。 氧的这一系列传递过程需要克服供氧方面和需氧方面的各种阻力才能完成。2、氧的传递方程式（1）双膜理论微生物发酵屮，通入发酵罐内的空气屮含有的氧不断溶解

12、于培养液屮，以供菌体细胞代谢之 需。氧从气相传递到液相，是气-液相间氧的传递过程，在这一传递过程中，气液界面的阻 力1/ki nj"以忽略，液体主流中的传递阻力1/klb很小也可忽略，此时主要的传递阻力存在 于气膜和液膜屮。对于这种传递过程的描述，应用最广的是双膜理论。这个理论假定在气泡和包围着气泡的液体之间存在着界面，在界面的气泡一侧存在着一层气 膜，在界面液体一侧存在着一层液膜，气膜内的气体分子与液膜小的液体分子都处丁层流状 态，分子之间无対流运动，因此氧分子只能以扩散方式，即借助于浓度差而透过双膜，另外, 气泡內除气膜以外的气体分子处于对流状态，称为气流主体，在空气主流空间的任

13、一点氧分 了的浓度和同，液流主体亦如此。（一）影响氧传质推动力的因素要想增加氧传递的推动力（c*一 cl）,就必须设法提高c*或降低cl。1、提高饱和溶氧浓度c*的方法a、温丿殳：降低温丿艾b、溶液的性质：-般来说，发酵液中溶质含量越高，氧的溶解度越小。c、氧分压：在系统总压力小于0.5mpa时，氧在溶液中的溶解度只与氧的分压成直线关系。 气相中氧浓度增加，溶液中氧浓度也增加。想提高c*就得降低培养温度或降低培养基中营养物质的含量，或提高发酵罐内的氧分压（即 提高罐压）。这儿种方法的实施均有较人的局限性。己知发酵培养基的纽成和培养浓度是依 据生产菌种的牛理特性和纶物合成代谢产物的需要而确定的，

14、不可任意改动。但有吋分批发 酵的中后期，由于发酵液粘度太大，补入部分灭菌水来降低发酵液的表观粘度，改善通气效 果。采用提高氧分压的方法，一是提高发酵罐压力，二是向发酵液通入纯氧气。提高罐压会 减小气泡体积，减少了气一液接触面积，影响氧的传递速率，降低氧的溶解度。影响菌体的 呼吸强度，同时增加设备负担。通人纯氧能显著提高cl,但此利方法既不经济又不安全， 同时易岀现微生物的氧屮毒现象。（2）、降低发酵液中的cl降低发酵液中的cl,可釆取减少通气量或降低搅拌转速等方式来降低kla,便发酵液中的 cl降低。但是，发酵过程中发酵液中的cl不能低于c临界，否则就会影响微生物的呼吸。 目前发酵所采用的设备

15、，其供氧能力已成为限制许多产物合成的主要因索之-，故此种方法 亦不理想。(二)、影响液相体积氧传递系数kla的因素经过长时间的研究和牛产实践证实，影响发酵设备的kla的主要因素有搅拌效率、空气流 速、发酵液的物理化学性质、泡沫状态、空气分布器形状和发酵罐的结构等。实验测出的 kla与搅拌效率、通气速度、发酵液理化性质等的关系可用下述的经验式表示：kla=k ( (p / v) a ). (vs) p ( n app)-)式中p/v单位体积发酵液实际消耗的功率(指通气情况下，kw / m3)；vs空气直线速度，m/h；0 app发酵液表观粘度,(kg s) / m，；a、0、3指数，与搅拌器和空

16、气分布器的形式等有关。k经验常数。1、搅拌效率对kla的影响发酵罐内装配搅拌器的作川冇：使发酵罐内的温度和营养物质浓度均一，使组成发酵液的 三相系统充分混合；把引入发酵液中的空气分散成小气泡，增加了气一液接触面积，捉高 kla值；强化发酵液的湍流程度，降低气泡周围的液膜厚度和湍流中的流体的阻力，从而 提高氧的转移速率；减少菌丝结团，降低细胞壁周围的液膜阻力，冇利于菌体对氧的吸收, 同时可尽快排除细胞代谢产生的“废气”和“废物”，冇利于细胞的代谢活动。应提出的是 如果搅拌速度快，山于剪切速度增大，茵丝体会受到损伤，影响菌丝体的正常代谢，同时浪 费能源。2、空气流速kla随空气流速的增加而增加,指

17、数0约为0.40.72,随搅拌器形式而异。但当空气流速 过大吋，搅拌器就出现“气泛”现彖，kl"不再增加。“气泛”现彖指的是在特定条件下， 通人发酵罐内的空气流速达某-值时，使搅拌功率下降，当空气流速再增加时，搅拌功率不再下降，此时的空气流速称为“气泛点” (floodingpoint)o 带搅拌器的发酵罐的气泛点，主要与搅拌叶的形式、搅拌器的直径和转速、空气线速度等相 关。对一定设备而言，空气流速与空气流量z间呈止相关性。空气流量的改变必然引起空气流速 的变化。已知空气流速的变化会引起体积氧传递系数kla的改变，当空气流速达气泛点时, kla不再增加。这样，空气流量的变化也会改变k

18、la,当空气流量达某一值时，kla也不 再增加，如图75所示。所以，在发酵过程中应控制空气流速(或流量)，使搅拌轴附近的液 面处没冇大气泡逸出。搅拌功率和空气流速对kla的影响，实验测出搅拌功率对抗生素产率的影响远大丁空气流 速。高搅拌转速，不仅使通人罐内的空气得以充分的分散，增加气一液接触面枳，而且还可 以延长空气在罐内的停留时间。空流速过大，不利于空气在罐内的分散与停留，同时导致发 酵液浓缩，影响氧的传递。但空气流速过低，因代谢产生的废气不能及吋排除等原因，也会 影响氧的传递。因此，要提高发酵罐的供氧能力，采用提高搅拌功率，适当降低空气流速, 是一种有效的方法。3、发酵液理化性质的影响kl

19、a与发酵液的表观粘度napp呈反比。说明发酵液的流变学性质是影响kla的主耍因素z 一。发酵液是由营养物质、生长的菌体细胞和代谢产物组成的。由于微生物的生长和多种代 谢作用使发酵液的组成不断地发牛变化，营养物质的消耗、菌体浓度、菌丝形态和某些代谢 产物的合成都能引起发酵液粘度的变化，致使发酵过程中的发酵液呈现多种流变学性质。以淀粉作碳源的培养基属于非牛顿型流体，在发酵过程中，随著微牛物的牛长和代谢作用， 其流变学性质不断变化。如牛产金毒索时，以淀粉作碳源，接种时，培养基呈平汉塑性流体 性质，发酵至22小时，由于微生物的代谢作用，发酵液粘度降至很低（低于18pas）,呈现 牛顿型流体性质。22小

20、时起由于菌丝体浓度不断增加，则发酵液粘度逐渐增大，直至粘度 达90pas、表现为涨塑性流体的性质。发酵过程中菌体浓度和形态在氧的传递速率方而显示一定影响。许多细菌和酵母菌发酵时, 发酵液粘度低，呈现丫顿型流体性质，对氧的转移没有什么影响。霉菌和放线菌发酵液多数 时间属于非牛顿型流体，粘度较人，对氧的转移有较人彩响。在单细胞和丝状菌发酵屮，对 数生长期两者的氧吸收速率是相同的，但在溶解氧浓度受到限制的条件下，达到平衡期，单 细胞发酵液的氧吸收速率无变化，而丝状菌发酵液的氧吸收速率却显著下降，其原因是丝状 菌发酵液的菌体浓度增加，使发酵液粘度不断增人，致使kla值降低，进而导致菌体的氧 吸收速率下降。在青霉素发酵屮，由于菌丝体浓度的不断增加，使发酵液粘度不断增人， kla却随z下降。在沉没培养过程中，由于搅拌的作用，有的菌体（尤其是霉菌）形成不连续的球状体，有的形 成交替的丝状体。一般说，球状体发酵液粘度低，呈现牛顿型流体性质，而丝状体会大大增 加发酵液的粘度，呈现非牛顿型流