chapter5-1 微生物的酶

1、第第 五五 章章微生物代谢微生物代谢1.1 酶通论酶通论第一节第一节 微生物的酶微生物的酶一、酶的概念一、酶的概念 （一）酶的生物学意义（一）酶的生物学意义 6CO2+6H2O+能量能量 C6H12O6+6O2 植物植物动物动物N2+3H2 500 ,300大气压大气压Fe2NH3酶酶N2 + 3H2 2NH3某些微生物某些微生物条件温和条件温和同一反应在化工生产中条同一反应在化工生产中条件苛刻件苛刻酶的威力！酶的威力！定义：定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂生物催化剂。（二）

2、酶是生物催化剂（二）酶是生物催化剂 1 1酶与一般催化剂的共同点酶与一般催化剂的共同点 （1 1）用量少而催化效率高）用量少而催化效率高 （2 2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反 应前后本身不发生变化应前后本身不发生变化 （3 3）降低反应所需的活化能）降低反应所需的活化能 例例 2H2H2 2O O2 22H2H2 2O+OO+O2 2 反反 应应活化能活化能非催化反应非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化酶催化8.36kJ/mol2 2酶作为生物催化剂的特殊点酶作为生物催化剂的特殊点 （5

3、5）酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关）酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高10107 710101313倍，比非催化反应高倍，比非催化反应高10108 810102020倍。倍。 （2 2）高效专一性）高效专一性 一种酶只能作用于某一类或某一特定物质（底物）一种酶只能作用于某一类或某一特定物质（底物） （3 3）酶易失活）酶易失活 大多数酶的本质是蛋白质，凡使蛋白质变性的因素，如强酸、强碱、大多数酶的本质是蛋白质，凡使蛋白质变性的因素，如强酸、强碱、高温都能使酶破坏而失活高温都能使酶破坏而

4、失活 （4 4）酶活力的调节控制）酶活力的调节控制 酶活力受到抑制剂、共价修饰、反馈、酶原激活及激素控制酶活力受到抑制剂、共价修饰、反馈、酶原激活及激素控制（1 1）高的催化效率）高的催化效率 有些酶是复合蛋白质，其中小分子物质（辅酶、辅基及金属离子）与有些酶是复合蛋白质，其中小分子物质（辅酶、辅基及金属离子）与酶的催化活性密切相关。若将它们除去，酶就失去活性酶的催化活性密切相关。若将它们除去，酶就失去活性酶的专一性酶的专一性1 1、绝对专一性（、绝对专一性（absolute specificityabsolute specificity） 例例: CONH2NH2H2O脲脲酶酶CO2 + 2

5、NH3CONH2NHCH3H2O脲脲酶酶X尿素类似物尿素类似物（1 1）族专一性）族专一性（基团专一性，（基团专一性，group specificitygroup specificity） 2 2、相对专一性（、相对专一性（relative specificityrelative specificity） A B 或 A B如如-D-D-葡萄糖苷酶，此酶要求必须是葡萄糖苷酶，此酶要求必须是D-D-葡萄糖通过葡萄糖通过-糖苷键形成的糖糖苷键形成的糖苷，而不要求苷，而不要求R R基团性质基团性质 OCH2OHOHOHOOHR（2 2）键专一性）键专一性 A BR1COOR2+ H2O酯酯酶酶R1C

6、OOH + R2OH上面的酯酶只对底物分子中所作用的键要求严格，而不管上面的酯酶只对底物分子中所作用的键要求严格，而不管键两端键两端R1R1、R2R2是什么性质的基团是什么性质的基团3、立体专一性（、立体专一性（stereospecificity） （1 1）D-D-，L-L-立体异构专一性立体异构专一性 （2 2）几何异构专一性）几何异构专一性（也即顺式和反式）（也即顺式和反式） CCHHHOOCCOOH+ H2O延延胡胡索索酸酸水水化化酶酶CH2COOHCHOHCOOH反反丁烯二酸，也丁烯二酸，也称延胡索酸称延胡索酸（三）酶的化学本质（三）酶的化学本质 1 1大多数酶是蛋白质大多数酶是蛋白

7、质（Most enzymes are proteins） 19261926年美国年美国SumnerSumner用刀豆制备出脲酶的结晶，指出酶是蛋白质用刀豆制备出脲酶的结晶，指出酶是蛋白质 19301930年年NorthropNorthrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。 J.B.SumnerJ.H.Northrop 2020世纪世纪8080年代发现某些年代发现某些RNARNA有催化活性，还有有催化活性，还有一些一些抗体抗体也有也有催化活性催化活性，甚至有些，甚至有些DNADNA

8、也有催化活也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 2 2某些某些RNARNA有催化活性有催化活性 19821982年美国年美国T. CechT. Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNArRNA前体能在完全没前体能在完全没有蛋白质的情况下进行有蛋白质的情况下进行自我催化自我催化加工，证明加工，证明RNARNA有催化活性。有催化活性。 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 19831983年美国年美国S.AltmanS.Altman等研究等研究RNasePRNaseP（由（

9、由20%20%蛋白质和蛋白质和80%80%的的RNARNA组成），发现组成），发现RNasePRNaseP（核糖核酸核糖核酸）中的）中的RNARNA可催化可催化E. E. coli tRNAcoli tRNA的前体加工。的前体加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和和Altman各自独立发现了各自独立发现了RNARNA的催化活性，并命名这的催化活性，并命名这一类酶为一类酶为核酶核酶（ribozyme），），2 2人共同获人共同获19891989年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。 3 3抗体酶（抗体酶（abzymeabzym

10、e） 抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。 抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区 （即肽链的（即肽链的N N端）是识别抗原的活性区域，这部分区端）是识别抗原的活性区域，这部分区 域被赋予了酶的属性域被赋予了酶的属性。 19861986年美国年美国SchultzSchultz和和LernerLerner两个实验室同时在两个实验室同时在ScienceScience上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。活性的抗体。 4 4有些有些DNADNA也有催化

11、活性也有催化活性 19951995年年CuenoudCuenoud等发现有些等发现有些DNADNA分子亦具有催化活性。分子亦具有催化活性。 （四）酶的化学组成（四）酶的化学组成 1 1单纯蛋白质酶类单纯蛋白质酶类 2 2结合蛋白质酶类结合蛋白质酶类 全酶全酶= =酶蛋白酶蛋白+ +辅助因子辅助因子（辅酶、辅基或金属离子（辅酶、辅基或金属离子） 辅酶（辅酶（coenzymecoenzyme） 辅基（辅基（prosthetic groupprosthetic group） 辅助因子作用：辅助因子作用：在酶促反应中在酶促反应中运输转移电子、原子或某些功能运输转移电子、原子或某些功能 基团参与氧化还原

12、反应基团参与氧化还原反应 重要辅助因子重要辅助因子：如脱氢酶重要辅酶：如脱氢酶重要辅酶 NADNAD、NADPNADP、FMNFMN、FADFAD等等NADNAD，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 辅酶辅酶NADPNADP，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸腺苷酸腺苷酸核糖核糖尼克酰胺尼克酰胺NCOOHNCONH2尼克酸尼克酸 尼克酰胺尼克酰胺VB5辅酶辅酶功能：功能：.以以NADNAD+ +或或NADPNADP+ +形式作为形式作为脱氢酶的辅酶脱氢酶的辅酶而起到递氢体的作用而起到递氢体的作用。NCONH2RNCONH2RHH+2H-2H14NAD(P)+ +2H

13、-2HNAD(P)H + H+维持神经组织的健康。尼克酰胺对中枢及交感神经系统有维护作维持神经组织的健康。尼克酰胺对中枢及交感神经系统有维护作用，缺乏，则常产生神经损害和精神紊乱。用，缺乏，则常产生神经损害和精神紊乱。维生素维生素B B2 2（核黄素（核黄素riboflavinriboflavin） 维生素维生素B B2 2又称核黄素（又称核黄素（riboflavinriboflavin），是一种核糖醇与），是一种核糖醇与6 6，7 7二甲基异咯嗪的缩合物。二甲基异咯嗪的缩合物。H2CCCCCHOHOH OH OHHHHHNNNCCONHOCH3CH3核糖醇基核糖醇基异咯嗪基异咯嗪基维生素维生

14、素B B2 2为橘黄色的针状晶为橘黄色的针状晶体，味苦，微溶于水，极体，味苦，微溶于水，极易溶于碱性溶液，易溶于碱性溶液，对光和对光和碱不稳定碱不稳定VB2 + ATP FMN + ADP FMN + ATP FAD +PPiO H2COHOH12345NNNNHHH9-OP=O OH2CCCCCH2OHOH OHOHHHHNNNCCONHOCH3CH3-OP=OOO-FADFAD，黄素腺嘌呤二核苷酸，黄素腺嘌呤二核苷酸维生素维生素B B2 2的生理功能是作为的生理功能是作为递氢辅酶，参与生物氧化递氢辅酶，参与生物氧化作用。作用。VB2维生素维生素B B2 2的生理功能是作为的生理功能是作为递

15、氢辅酶，参与生物氧化递氢辅酶，参与生物氧化作用。作用。VB2FADFAD、FMNFMN的生理功能的生理功能是作为递氢辅酶，参是作为递氢辅酶，参与生物氧化作用。与生物氧化作用。VB2二、酶的命名和分类二、酶的命名和分类 19611961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（enzyme commissionenzyme commission）提）提出的酶的命名和分类方法。出的酶的命名和分类方法。 （一）命名（一）命名习惯命名法习惯命名法国际系统分类法国际系统分类法（按照酶所催化的化学反应类型）（按照酶所催化的化学反应类型）6 6大类酶，氧、转、水、大类酶，氧、转、水、 裂、异、连裂、异、连（二）六

16、大类酶催化反应的性质（二）六大类酶催化反应的性质 1 1氧化还原酶类（氧化还原酶类（oxido-reductasesoxido-reductases） 催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。氢酶、过氧化物酶等。 （1 1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H H2 2O O或或H H2 2O O2 2 。2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 邻苯二酚氧化酶邻苯二酚氧化酶邻苯二酚邻苯二酚邻苯醌邻苯醌例：例：OHOH+ O2邻邻苯苯二二酚酚氧氧化化酶酶OO

17、2+ 2H2O2（2 2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 A2H + B A + B2H 例：乳酸脱氢酶例：乳酸脱氢酶 乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸COOHC HCH3H O+ NAD+COOHCOCH3+ NADH + H+乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶2 2转移酶类（转移酶类（transferasestransferases） 催化基团的转移催化基团的转移 AR+ BBRA +例：谷丙转氨酶（例：谷丙转氨酶（GPTGPT）3 3水解酶类（水解酶类（hydrolaseshydrolases） AB + HAB + H2 2O O A AOH + BHOH + BH 常见的水解酶：淀粉酶

18、、核酸酶、蛋白酶、脂酶等常见的水解酶：淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶等4 4裂合酶类（裂合酶类（lyaseslyases） 从底物移去一个基团而形成双键或逆反应从底物移去一个基团而形成双键或逆反应 AB A + B 例例1 1：例例2 2：5 5异构酶类（异构酶类（isomeraseisomerase） 催化异构化反应催化异构化反应 例：例：AB6 6连接酶类（连接酶类（ligases, 也称也称synthetases 合成酶类合成酶类） 将两个小分子合成一个大分子，通常需要将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATPATP供能。供能。 例：例： 乙酸+CoASH+ATP 乙酰SCoA+AMP+P

19、PiA + B + ATP AB + ADP + PiA + B + ATP AB + AMP + PPi三、酶的分离、提纯及活力测定三、酶的分离、提纯及活力测定 （一）酶的分离提纯（一）酶的分离提纯(不讲不讲) 基本原则：基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液性，操作中加入缓冲溶液. .基本操作程序：基本操作程序：a.a.选材选材：微生物（微生物发酵物微生物（微生物发酵物: : 胞内酶，胞

20、外酶），动物（动物器胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：脏：消化酶，血液：SODSOD酶，尿液：尿激酶等）酶，尿液：尿激酶等）, ,植物（木瓜蛋白酶，植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）。菠萝蛋白酶等）。b.b.抽提抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等）声波破碎，反复冻融或自溶等）c.c.分离分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。d.

21、d.纯化纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。滤等方法。酶的制剂形式：酶的制剂形式：a.a.固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）b.b.液体液体保存：低温下短期保存。保存：低温下短期保存。（二）酶的活力测定（二）酶的活力测定概念概念酶活力酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，为酶活力，通常用在一定条件下酶所催化的化学反应速度通常用在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表来表示。示。基本原理基本原

22、理: :酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即度成正比（即V=KV=KE E），故酶活力测定的是化学反应速度，），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。一定条件下可代表酶活性分子浓度。（二）

23、酶的活力测定（二）酶的活力测定I.I.酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)(P)的生成（增加）量或底物（的生成（增加）量或底物（S S）的消耗（减少）量。）的消耗（减少）量。即测定时需确定三种量：即测定时需确定三种量：加入一定量的酶；一定时间加入一定量的酶；一定时间间隔；物质的增减量。间隔；物质的增减量。II.II.测定酶活力常有以下几种方法：测定酶活力常有以下几种方法：v在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化

24、学反应时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是初速度初速度。v在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间，（非初速度，为一测定完成该反应（底物反应完）所需的时间，（非初速度，为一平均速度）。平均速度）。v动态连续测定法动态连续测定法。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。酶促反应过程中底物的消耗或产物的生

25、成。v快速反应追踪法快速反应追踪法。近年来，追踪极短时间（近年来，追踪极短时间（1010-3-3s s以下）内反应过以下）内反应过程的方法和装置已经应用。程的方法和装置已经应用。（三）酶活力的表示方法（三）酶活力的表示方法 I.I.酶活力单位酶活力单位酶活力酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示，单位为增加量表示，单位为mol/minmol/min等。等。酶活力单位酶活力单位的基本定义的基本定义为：特定条件（最适条件）下一定为：特定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。时间内催化完成一定化学反应量所需的酶

26、量。国际单位国际单位：用活力单位用活力单位U U（UnitUnit）表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或）表示，许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成某一固定条件下每分钟催化生成1 1molmol产物所需的酶量为一个酶产物所需的酶量为一个酶活力单位。活力单位。一个一个“KatalKatal”单位是指在一定条件下单位是指在一定条件下1 1秒钟内转化秒钟内转化1mol1mol底物所需底物所需的酶量。的酶量。KatKat和和U U的换算关系：的换算关系：1 Kat=61 Kat=610107 7U U，1U=160671U=16067n n KatKatII.II.比活力比活力（

27、specific activityspecific activity）酶的比活力是每单位（一般是酶的比活力是每单位（一般是mgmg）蛋白质中的酶活力单位）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位数（如：酶单位/mg/mg蛋白），实际应用中也用每单位制剂蛋白），实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL/mL（液体制剂），（液体制剂），酶单位酶单位/g/g（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高（固体制剂），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价所以比活力是评价酶纯度高低的一个指

28、标。酶纯度高低的一个指标。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。 回收率回收率= =某纯化操作后的总活力某纯化操作后的总活力/ /某纯化操作前的总活力某纯化操作前的总活力 总活力总活力= =比活力比活力总体积（总重量）总体积（总重量）1.2 酶促反应的速度及其影响因素酶促反应的速度及其影响因素影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素一、底物浓度一、底物浓度二二、 抑制剂抑制剂三三、 激活剂激活剂四、酶浓度四、酶浓度五五、温度、温度六、六、pH值值在低底物浓度时在低底物浓度时, , 反应速反应速度与底物浓度成正比，表度与底物浓度成

29、正比，表现为现为一级反应特征一级反应特征。当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大合后，反应速度达到最大值（值（V Vmaxmax），此时再增加），此时再增加底物浓度，反应速度不再底物浓度，反应速度不再增加，表现为增加，表现为零级反应零级反应。一一、底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响 （一）在酶浓度，（一）在酶浓度，pHpH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：和反应速度的关系。如右图所示：v 底物浓度与酶促反应速率的关系呈双曲线，即当底底物浓

30、度与酶促反应速率的关系呈双曲线，即当底物浓较低时，反应速率与底物浓度呈正比关系，表现为物浓较低时，反应速率与底物浓度呈正比关系，表现为一级反应一级反应；v 当底物浓度逐渐增加时，反应速率不再按正比关系当底物浓度逐渐增加时，反应速率不再按正比关系升高，反应表现为混合级反应；当底物浓度达到足够高升高，反应表现为混合级反应；当底物浓度达到足够高时，时，反应速率与底物浓度几乎无关反应速率与底物浓度几乎无关，反应达到最大反应，反应达到最大反应速率，表现为零级反应。速率，表现为零级反应。酶促反应动力学：酶促反应动力学：（二）（二）米氏方程米氏方程l19131913年，德国化学家年，德国化学家Michael

31、isMichaelis和和MentenMenten根据根据中间产物学说中间产物学说对酶对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为反应速度关系的著名公式，称为米氏方程米氏方程。V=Vmax SKm + SK Km m 米氏常数米氏常数V Vmaxmax 最大反应速度最大反应速度S S底物浓度底物浓度酶与底物生成一个酶与底物生成一个不稳定的中间产物不稳定的中间产物反应速度为最大值的反应速度为最大值的一半时的底物浓度一半时的底物浓度当向酶溶液加入底当向酶溶液加入底物时荧光强度发生物时荧光强度发生改变

32、，发生这种现改变，发生这种现象的唯一解释是酶象的唯一解释是酶与底物之间发生了与底物之间发生了某种作用某种作用中间产物中间产物学学说实验证据说实验证据l 米氏方程的推导米氏方程的推导S: 底物底物P: 产物产物E: 酶酶酶促反应速度由有效酶酶促反应速度由有效酶浓度即和底物结合的酶浓度即和底物结合的酶浓度浓度ESES决定决定底物浓度很高时底物浓度很高时底物浓度很低时底物浓度很低时米氏方程米氏方程l 米氏常数米氏常数Km 的意义的意义: :V=Vmax SKm + S上式表示上式表示, ,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。物浓度。单位为单位为mol/

33、Lmol/L（切记！）（切记！）亲和程度亲和程度 K2+K3Km= K1 K1E+S = ES P+E K2 K3l 米氏常数米氏常数Km Km 的的测定：测定：测定测定KmKm和和V V的方法很多，最常用的是的方法很多，最常用的是LineweaverLineweaverBurkBurk的作的作图法图法 双倒数作图法双倒数作图法。取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmaxmax S S V Vmaxmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vm

34、ax1/Vmax-1/Kmy=ax+b二二、抑制剂对酶反应速度的影响抑制剂对酶反应速度的影响有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),),使酶的使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为这种现象称为酶的抑制作用酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物称为能够引起酶的抑制作用的化合物称为抑制剂抑制剂(inhibitor)。 酶的抑制剂一般具备两个方面的酶的抑制剂一般具备两个方面的特点特点： a.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态在化学结构上与被抑制的底物分子

35、或底物的过渡状态相似。相似。 b.b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。稳定的复合体或结合物。（一）抑制作用的类型：（一）抑制作用的类型：(1)(1)不可逆抑制作用不可逆抑制作用：抑制剂与酶抑制剂与酶反应中心活性反应中心活性基团基团以以共价形式共价形式结合，引结合，引起酶的起酶的永久性失活永久性失活。如有。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。酯。 (2)(2)可逆抑制作用可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以抑制剂与酶蛋白以非共价方式非共价方式结合，引起酶活性结合，引起酶活性暂时性丧失暂时性丧失。抑制剂可以

36、通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类： 竞争性抑制：竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构某些抑制剂的化学结构与底物相似与底物相似，因而能与底物竟争与酶，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，

37、即提高底物的竞争能力来消除。能力来消除。竞争性抑制可用下式表示：竞争性抑制可用下式表示：可逆抑制作用可逆抑制作用竞争性抑制竞争性抑制l 竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的速度方程：V=Vmax SKm + S详细推导见生物化学教材详细推导见生物化学教材没有没有抑制抑制剂的剂的方程方程可逆抑制作用可逆抑制作用l竞争性抑制作用的竞争性抑制作用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：有竞争性抑制剂存在时，有竞争性抑制剂存在时，KmKm值增大值增大可逆抑制作用可逆抑制作用 非竞争性抑制：非竞争性抑制：l酶酶可同时与底物及抑制剂结合可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构

38、象变化，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与并不是与底物竞争与活性中心的结合活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。，所以称为非竞争性抑制剂。l如某些金属离子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+ +、HgHg2+2+）以及）以及EDTAEDTA等，通常等，通常能与酶分子的调控部位中的能与酶分子的调控部位中的-SH-SH基团作用，改变酶的空间基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。构象，引起非竞争性抑制。l非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。l非竞争性抑制可用下式

39、表示非竞争性抑制可用下式表示：可逆抑制作用可逆抑制作用非竞争性抑制非竞争性抑制l非竞争性抑制作用的速度方程：非竞争性抑制作用的速度方程：没有抑没有抑制剂的制剂的方程方程V=Vmax SKm + S可逆抑制作用可逆抑制作用l非竞争性抑制作用的非竞争性抑制作用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：可逆抑制作用可逆抑制作用三三、激活剂对酶促反应速度的影激活剂对酶促反应速度的影响响凡是能提高酶活力的简单化合物都称为凡是能提高酶活力的简单化合物都称为激活剂激活剂（activator)activator)。其中大部。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。分是一些无机离子和

40、小分子简单有机物。如：如：NaNa+ +、K K+ +、Ca2Ca2+ +、MgMg2+2+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、CoCo2+2+、CrCr2+2+、FeFe2+2+、ClCl- -、BrBr- -、I I- -、CNCN- -、NONO3 3- -、POPO4 4- -等；等；四四、酶浓度对酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响 在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。浓度成正比。这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部这些离子可与酶分子