酶反应动力学技术研究ppt课件

1、酶反响动力学 主要研讨酶催化的反响速度以及影响反响速度的各种要素 在讨论各种要素对酶促反响速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反响速度，即底物转化量k+2k-1k+2时，时，Km=k-1/k+1=KsKm=k-1/k+1=Ks。 Km Km可用于判别反响级数：当可用于判别反响级数：当S0.01KmS100KmS100Km时，时，=Vmax=Vmax，反响为零级反响当，反响为零级反响当0.01KmS100Km0.01KmS100Km时，反响处于零级反响和一级时，反响处于零级反响和一级反响之间，为混合级反响反响之间，为混合级反响 关于Km和Vmax的意义有以下论述：KmKm是酶的特征性常数：

2、在一定条件下，某是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的种酶的KmKm值是恒定的，因此可以经过测定值是恒定的，因此可以经过测定不同酶特别是一组同工酶的不同酶特别是一组同工酶的KmKm值，来值，来判别能否为不同的酶判别能否为不同的酶 。KmKm可用来判别酶的最适底物：当酶有几种可用来判别酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，不同的底物存在时，KmKm值最小者，为该酶值最小者，为该酶的最适底物的最适底物 关于Km和Vmax的意义有以下论述：KmKm可用来确定酶活性测定时所需的底物浓可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当度：当S=10KmS=10Km时，时，=91%Vmax=91%Vmax，为

3、最适，为最适宜的测定酶活性所需的底物浓度。宜的测定酶活性所需的底物浓度。 VmaxVmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度知时，可计算出酶的转换浓度和最大速度知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。变为产物的分子数。酶的浓度对于反响速度的影响 当反响系统中底物的浓度足够大时，酶当反响系统中底物的浓度足够大时，酶促反响速度与酶浓度成正比，即促反响速度与酶浓度成正比，即=kE=kE。其他要素对于酶促反响速度的影响 普通来说，酶促反响速度随温度的增高而普通来说，酶促反响速度随温度的增

4、高而加快，但当温度添加到达某一点后，由于加快，但当温度添加到达某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反响速度迅速下降酶蛋白的热变性作用，反响速度迅速下降 察看察看pHpH对酶促反响速度的影响，通常为一对酶促反响速度的影响，通常为一钟形曲线，即钟形曲线，即pHpH过高或过低均可导致酶催过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pHpH值就称为酶的最适值就称为酶的最适pH pH 酶的抑制剂 定义：凡是能降低酶促反响速度，但不引定义：凡是能降低酶促反响速度，但不引起酶分子变性失活的物质起酶分子变性失活的物质 分类：不可逆抑制造用和可逆抑制造用分类：不可

5、逆抑制造用和可逆抑制造用 。不可逆抑制造用 定义：抑制剂与酶分子的必需基团共价结定义：抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简一方法使酶活性恢复的抑制造用简一方法使酶活性恢复的抑制造用 。 分类：酶的不可逆抑制造用包括专注性抑分类：酶的不可逆抑制造用包括专注性抑制如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制和制如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制和非专注性抑制如路易斯气对巯基酶的抑非专注性抑制如路易斯气对巯基酶的抑制两种制两种 。可逆抑制造用 定义：抑制剂以非共价键与酶分子可逆性定义：抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等结合

6、呵斥酶活性的抑制，且可采用透析等简一方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复简一方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制造用的抑制造用 。 分类：竞争性、反竞争性和非竞争性抑制分类：竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型几种类型 。可逆抑制造用 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低催化活性降低 特点：特点：a.a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反响产物；反响产物；b.b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶抑制剂与酶的结合部位与底

7、物与酶的结合部位一样；的结合部位一样；c.c.抑制剂浓度越大，那么抑制抑制剂浓度越大，那么抑制造用越大；但添加底物浓度可使抑制程度减小；造用越大；但添加底物浓度可使抑制程度减小；d.d.动力学参数：动力学参数：KmKm值增大，值增大，VmVm值不变。值不变。 可逆抑制造用 反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与，但可与ESES复合物结合并阻止产物生成，复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低使酶的催化活性降低 。 特点：特点：a.a.抑制剂与底物可同时与酶的不同抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；部位结合；b.b.必需有底物存在，抑制剂才必需有底

8、物存在，抑制剂才干对酶产生抑制造用；干对酶产生抑制造用；c.c.动力学参数：动力学参数：KmKm减小，减小，VmVm降低。降低。 可逆抑制造用 非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与可以与ESES复合物结合，使酶的催化活性降低复合物结合，使酶的催化活性降低 。 特点特点:a.:a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；相结合；b.b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改动对抑制程度无影响；底物浓度的改动对抑制程度无影响；c.c.动力学参动力学参数：数：KmKm值

9、不变，值不变，VmVm值降低值降低 酶的激活剂 定义：定义：KmKm值不变，值不变，VmVm值降低。可以促使值降低。可以促使酶促反响速度加快的物质酶促反响速度加快的物质 。 酶的激活剂大多数是金属离子，如酶的激活剂大多数是金属离子，如K+K+、Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-Cl-。举例1：草甘膦N-乙酰转移酶反响动力学研讨 酶反响动力学利用酶反响动力学利用Thermo MULTISKANSPECTRUMThermo MULTISKANSPECTRUM酶标仪酶标仪, ,经经过延续分光光度分析法进展分析。将过延续分光光度分析法进展分析。将5

10、L GAT5L GAT酶液参与到酶液参与到295L295L的测活缓冲液的测活缓冲液(25mmol/L Hepes,pH (25mmol/L Hepes,pH 6.8,167mol/L AcCoA,10%6.8,167mol/L AcCoA,10%乙二醇乙二醇,0.12510.000 mmol/L,0.12510.000 mmol/L草甘膦草甘膦) )中中, ,以不加酶液的测活缓冲液作为对照。在以不加酶液的测活缓冲液作为对照。在235 nm235 nm处测定不同浓度梯度的草甘膦底物条件下的紫外分光光度处测定不同浓度梯度的草甘膦底物条件下的紫外分光光度值值, ,每隔每隔5 s5 s读读1 1次数次

11、数, ,不断到不断到60 s60 s。经过不同草甘膦底物的。经过不同草甘膦底物的浓度浓度SS下下GATGAT催化转乙酰反响的反响速率催化转乙酰反响的反响速率v,v,以以1/S1/S为横为横坐标坐标1/v1/v为纵坐标为纵坐标,Lin-eweaver-Burk,Lin-eweaver-Burk法双倒数作图法双倒数作图, ,求出求出米氏常数米氏常数KMKM和最大速率和最大速率vmax,vmax,而催化常数而催化常数kcat=vmax/E,Ekcat=vmax/E,E为酶浓度。详细测定方法参照文献为酶浓度。详细测定方法参照文献2-2-33。GATGAT酶的活性用催化效率酶的活性用催化效率kcat/K

12、Mkcat/KM表示。数据处置软件表示。数据处置软件为为GraphPad PrismGraphPad Prism。 举例2:磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反响动力学的影响 经过添加经过添加VcVc和外加磁场处置和外加磁场处置, ,研讨莲藕多酚氧化酶研讨莲藕多酚氧化酶(PPO)(PPO)反反响动力学的变化规律。以邻苯二酚为底物响动力学的变化规律。以邻苯二酚为底物, ,莲藕莲藕PPOPPO褐变反褐变反响动力学符合米氏方程所描画的单底物酶促反响动力学响动力学符合米氏方程所描画的单底物酶促反响动力学,Km,Km为为0775 mol/L,Vmax0775 mol/L,Vmax为为11150 U/min11150 U/min。VcVc对对PPOPPO有较有较强的抑制造用强的抑制造用, ,反响动力学参数反响动力学参数KmKm为为0081 mol/L,Vmax0081 mol/L,Vmax为为3243 U/min,3243 U/min,呈现反竞争性抑制呈现反竞争性抑制, ,表现为褐变出现滞后表现为褐变出现滞后, ,随随VcVc浓度的增大滞后时间逐渐增长浓度的增大滞后时间逐渐增长, ,且呈现且呈现S S型趋势型趋势,