吡柔比星与温热协同对胃癌组织的体外作用

1、大学课堂教学的组织行为与教学模式【摘要】大学课堂教学组织柔比星和其他化疗药物对 胃癌组织温热协同的作用，探讨化疗药物与温热化疗的协同 作用机制。方法利用36个病例的手术切除胃癌组织，建立 人胃癌组织体外立体培养作用模型，mts pms比色法检测组 织培养物活性以了解化疗药物以及温热化疗的抑瘤效果。 tunel荧光检测原位细胞凋亡，he染色研究评价药物对胃癌 组织在组织形态学上的改变并进行电镜观察。结果ddp、画c 和thp对胃癌组织的杀伤均具有较强的温热协同关系，thp单 独处理和温热协同处理均具有较强的抑制作用，和其他3种 药物抑制率比较具有显著性差异。thp和温热协同处理效果 和胃癌病例组

2、织学分级有关，而与年龄、性别、肿瘤大小、 临床分期和术前cea水平无关。thp温热协同处理凋亡指数 和其他3种药物比较具有显著性差异。he染色表明，thp和 温热处理后，胃癌组织大部崩解，细胞变性坏死。电镜分析 表明经thp和温热协同处理后细胞胞膜内陷，胞浆空泡化， 并出现染色质浓聚，同时核膜消失。结论thp对胃癌组织具 有良好的温热协同效应和肿瘤杀伤效果，具有进一步临床研 究价值。【关键词】吡柔比星；温热效应；胃癌chemotherapyenincombinationwithffectsofpirarubicihyperthermiaongastriccancertissuesin vitr

3、oabstract :objective comparisonoftheeffectsofpirarubicin (thp)incombinationwithhyperthermiaongastriccancertissuesinvitroandtodiscusstheunderlying invitrothreedimensionalactingmodelswereestablishedwith tissuebiopsiesfrom36patientswithpathologicallyconfirmedgastricce llviabilitywasmeas uredbymts pmsfl

4、uorescencedetectionin situapoptosis,hestainingwasusedtostu fdrugtreatedgastri d synergisticeffecrtumortissuesweretrmiaandthreedrugsi thp,andmitomycin (p edsuperiorcytotoxi gsoncancer,histomo suggestedstrongkil cancertissues,incl uestructure,celluldyhistomorphologyo cmicroscopeobserve tswereobserveda

5、fte reatedwithhyperthe ncludingcisplatin, =),whilethpexhibit ceffectstootherdrurphologicalstudies lingeffectsofthpon udingdisruptedtiss ardegradationandnecrosis,karyopyknos isandkaryolysis,al sowithlossofologicalgrading(p=),whileirrelatedtopatients1gender,age,tumorsize ，clinialstagingandpreoperative

6、cealevels (p>).theapoptosisindexhassignificantdiff erencecomparedtiipandtheotherthreetreatedbythp,thegastrictissuesdisaggregation,andelectronmicroscopeobservedcellmembraneinvagination,endochylemamembrane synergisticeffectsofpirarubicinincombinationwithhyperthermiawereevident；cytotoxicityofpirarub

7、icinwasthermallyenhancedconsiderablybymildhyperthermiaongastriccancermaybeapot entialtherapeuticd rugforintra perito nealchemohyperther mia.keywords：pira rubicin； hypertherm ia； gastriccancer0引言消化道恶性肿瘤是临床最常见的恶性肿瘤，目前手术切 除仍是治疗消化道肿瘤的首选方法，但对进展期胃肠道恶性 肿瘤，根治手术后仍有较高的复发率。术中腹腔内温热灌注 化疗（itraope rativeperitoneal

8、hy perthermiachemotherapy，iphc)直接作用于上述复发和转移部位，对预防胃肠道 恶性肿瘤根治术后复发有一定作用，且副作用小，是近年来 国内外研究的热点之一。然而，对于浸润腹膜下较深的肿瘤， hipec化疗后仍有腹膜复发。因此，研究和应用穿透性好的 药物，提高药物穿透能力，增强热的渗透效应将是今后的研 究方向。本研究拟建立胃癌组织小块三维培养技术，研究吡 柔比星对胃癌组织的温热协同效应和作用机制。1材料和方法胃癌标本x xxx年本院行根治性胃大部切除或胃全切 的胃癌手术标本36例，均经病理学明确诊断。其中，男22 例，女14例，年龄3385岁，平均岁。患者临床分期、病

9、理组织学分类、术前cea水平和肿瘤直径资料，见表1。表 1胃癌病例背景资料和thp温热抑制率化疗药物顺铂(ddp)购自齐鲁制药厂，吡柔比星(thp)由深圳万乐 医药有限公司提供，丝裂霉素为日本协和发酵产品，氟尿嘧 啶注射液为浙江海普制药公司产品。药物储存液根据说明书 进行配制，储存于-20°c冰箱。试剂和耗材无酴红rpm 11640和胎牛血清为hyclone公 司产品；mts购自promega公司；硫酸酚臻甲酿(phenazine methosulfate,pms)、dmso、新霉素和两性霉素b均为si gma 公司产品；胶原蛋白海绵为北京益而康生物技术有限公司产品，规格为10 xx

10、，海绵使用前剪成大小；24孔培养板为costar 产品。温热效应研究根据hoffman1等方法，手术标本剥离表 面的脂肪和纤维组织，用pbs清洗其表面的血污和脏物，然 后将标本置于含有抗生素的浸泡液中浸泡15mi n。再加入 1640培养液进行洗涤，用手术刀将标本尽量切割成1mm大小 的小块，3块组织块加入胶原海绵上，然后转移至已预加培 养基的24孔板孔中，培养箱37°c培养过夜。第二天每孔沿 孔壁缓慢加入含有药物的培养基ml，每个药物浓度3个平行 孔，于42°c作用lh，然后吸出药物，培养基洗2次，加入 新鲜培养液lml继续培养3d。目前thp在温热化疗方面的应 用报道甚

11、少，本研究参考其静脉用药剂量(40mg/m2)，浓度设 定为32ug/ml。其他药物浓度参考文献报道1，其中，ddp 处理浓度为50以/1111，丽(：浓度为151/1111，氟尿嘧啶为350 p g /ml。(以dpbs配制成2mg/ml，pm滤膜过滤除菌，分装。pms 的配制：以pbs配制成100mmol/l的贮存液，ym滤膜过滤 除菌，4°c避光保存。mts pms使用液：在新配制的mts 中以20 : 1体积比加入pms混和即用。mtspms测定方法:24孔培养板每孔加入looul的mts pms使用液，继续培 养4h后，振荡10 min,每孔取100 yl，以490nm的波

12、长测定吸光度值，取三个平行孔均值。抑制率（%）=（加药孔0d-空白孔0d） / （对照孔0d-空白孔 od） x100荧光检测原位细胞凋亡药物处理后的组织小块置于恒 冷箱冰冻切片机切片架上，待组织块冷冻变硬后切片，厚度 为57um。4°/。多聚甲醛中4°c固定30min，1 00冰上穿透5min, pbs洗涤3次，共15min。加入fitc标 记的tune1反应混合物，37°c湿盒反应90min,然后用pbs 洗涤3次，共3 0min，80%磷酸甘油封片。取非坏死区荧光显 微镜观察计数200个以上细胞，作阳性率统计。组织和细胞形态学研究药物处理后的组织小块置于10

13、%中性甲醛中4°c固定48h 经系列乙醇脱水，石蜡包埋后切片。切片经苏木素和伊红染 色，显微镜下观察温热化疗前后肿瘤组织形态学变化；用于 电镜分析的标本采用2%戊二醛固定，然后依次经四氧化硪处 理和梯度脱水后，包埋并切片镜检。统计学分析采用spss统计分析软件。化疗药物温热协同作用与单 独化疗药物两组比较采用配对t检验；各个化疗药物间作用 的差异分析采用单向方差分析，t hp对胃癌组织的抑制作用 和一些临床因素的相关性分析采用双变量相关分析，计算 spearman相关系数。2结果温热化疗对胃癌组织的作用4种药物对胃癌组织均具有一定的杀伤作用，见表2。 其中，ddp、醒c和thp三种药

14、物具有温热协同效应，温热处 理的抑制作用均较单独处理有所增强；5 fu未见明显温热 协同效应。thp单独处理和温热协同处理均具有较强的抑制 作用，和其他3种药物抑制率比较具有显著性差异。表2药 物对胃癌组织的温热协同抑制率对胃癌组织作用和临床因素的关系th p对胃癌组织的抑制作用和一些临床因素的相关性研 究表明，thp对肿瘤的抑制效应和年龄、性别、术前cea水 平、临床分期和肿瘤大小无关，而与肿瘤的病理学分级有关。 随着组织分级从高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌到印 戒细胞癌，thp抑制率呈现下降趋势。37°c时spearman相关 系数y=_，p=; 42°c时spea

15、rman相关系数y而其他几种化疗药物ddp、丽c、5 fu无论是在37°c或者是 42°c情况下，对肿瘤的抑制效应和年龄、性别、术前cea水 平、临床分期、肿瘤大小和肿瘤组织分级均无关。原位细胞凋亡检测4种药物对胃癌组织均具有一定的凋 亡诱导作用，见表3，图la、b。其中，ddp、mmc和thp三 种药物具有温热协同效应，温热处理均较单独处理具有显著 增加的凋亡指数。thp温热协同处理均具有较强的凋亡效应， 其凋亡指数和其他3种药物比较具有显著性差异。表3四 种药物的温热化疗对胃癌组织的凋亡诱导作用染色和电镜分析h e染色结果表明，thp和温热协同对 胃癌组织具有显著的杀伤

16、效应，光镜视野下肿瘤组织丧失完 整的形态结构，肿瘤细胞严重坏死，细胞核大部分固缩，胞 浆散失并伴有大量核碎片化现象，见图lc、d。电镜分析表 明经thp和温热协同处理后细胞呈现早期、中晚期凋亡特征， 胞膜内陷，胞浆空泡化，并出现染色质浓聚，同时核膜消失，3讨论胃癌占消化道肿瘤死亡人数的一半和各种恶性肿瘤死 亡总数的1/5,居恶性肿瘤死亡的前列。近些年来，随着外 科手术的进展，术后淋巴结复发已明显减少，取而代之的是 腹腔转移和复发。如何预防术后腹腔复发是胃肠道肿瘤急待 解决的问题。目前，术中腹腔内温热灌注化疗已逐渐成为大多数学者 公认的治疗进展期胃肠道肿瘤的有效方法。术中腹腔内温热 灌注化疗使胃

17、肠道肿瘤术后腹腔转移和复发取得明显疗效， 并能显著提高生存率，但其中还有许多细节问题值得探讨， 如化疗药物的选择、具体方法的选择、药液容量、剂量的确 定等，都是亟待解决的问题。吡柔比星化学结构中有一四氢吡喃基团，因此能够部分 绕过gpl70糖蛋白所介导的对阿霉素的耐药性2。研究表 明，白血病细胞hl 60对thp的摄入非常迅速，在lug/ml 的浓度下30s内thp的累积摄入量为ug，主要吸收进入细 胞核；而阿霉素仅为yg，大部分处于胞浆，同时，thp的排 出较慢，细胞内能保留高浓度3。sugano等4在膀胱癌 腔内灌注动物模型中的研究表明，thp对癌肿有较强的穿透 性，能够在60min内穿透

18、23mm组织，而阿霉素仅能穿透1mm 因此，thp在温热灌注化疗中具有较好的临床应用前景。目前，国际上有关thp在温热灌注化疗中的基础研究和 临床应用的报道甚少。本研究结果显示thp42°c协同对胃癌 组织的杀伤效应高于目前的常用药如ddp、mmc和5 fuo 本研究前期工作表明，人胃癌mgc 803细胞经thp和温热 协同处理后，处于s期的细胞增多，g2/m期细胞减少5。有报道表明，thp对处于g2/m期细胞的杀伤作用最强， 而对g0/1期细胞的杀伤作用较弱。由于温热协同不能增加 细胞对thp的摄取。因此，通过温热处理阻滞细胞周期于g2/m 期，是增加细胞对thp的敏感性的重要机制

19、。临床因素相关性分析表明，thp在37°c或者42°c的杀伤 作用和患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小和术前cea水 平没有明显关系，而与胃癌的组织病理学分级有关，其抑制 作用在高分化腺癌最强。国外临床试验研究表明，术中温热 灌注化疗的临床疗效和临床分期有关，对于胃癌ii、iii期患者，术中温热灌注化疗能够显著延迟复发，延长患者生存时 间，而对于iii期以上患者，术中腹腔内温热化疗并无显著性 生存优势6。考虑本研究是局部对胃癌组织的体外研究， 影响因素相对比较少，而临床研究结果与很多临床因素有关 比如术中腹腔内温热化疗的术中副作用和相关并发症的可 能对临床疗效均有影响。所以

20、thp对胃癌组织的抑制作用的 高低与临床疗效的好坏不一致并不矛盾。一般认为在全身化疗中，肿瘤分化程度低，thp的作用 效果好。而本研究结果提示肿瘤分化程度高，thp抑制肿瘤 组织作用效果好。这可能与本研究使用局部化疗时药物浓度 远远高与全身化疗的药物浓度有关。由于thp的渗透性好， 渗透入细胞内药物浓度远远高于耐药蛋白将药物泵出肿瘤 细胞的浓度，这时耐药蛋白对抗拒化疗所起的作用相对很小 故thp灌注化疗对耐药蛋白功能较完善的高分化的肿瘤细胞 效果更好。而其他的化疗药物如ddp、丽c、5 fu与组织学 分级无相关性的原因也可能与它们的渗透性相对较差有关。综上所述，thp对胃癌组织具有良好的温热协同效应和 肿瘤杀伤效果，具有腹腔内温热灌注化疗的研究应用价值。 在临床上选择合适的临床分期和组织学分级胃癌病例在e 手术期进行术中腹腔内温热化疗是有意义的。【参考文献】furukawat，kubotat,hoffmanapplicationsofthehistoculturedrugresponseassayj. clincancerres,1995,1 (3):305311.2 furuka wat, kubotat, murata h, etspectraofanthracyclinesagainst