人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34造血干祖细胞扩增(精)

1、人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34 造血干/ 祖细胞扩增与分化的作用作者：王建伟，王亚平，王莎莉，姜蓉 【摘要】 为探讨人参总皂甙( total saponins of panax ginseng, TSPG ) 协同造血生长因子体外诱导 CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC 扩增与分化的作 用，收集人脐血、骨髓细胞并采用 StemsepTM 干细胞分选系统分离纯化 CD34+ HSC/HPC 用不同剂量 TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养，检测细胞 总数、CD34 钿胞和 CD33 细胞比例及集落形成细胞总数(CFC、粒系祖细胞 (CFU-GM 数量变化。结果显示：10-

2、70 卩 g/mlTSPG 均可不同程度地提高脐血 细胞总数、CFC 数和 CD34 钿胞数，50 卩 g/ml 是最佳刺激浓度，可使细胞总 数、CFC 数和 CD34 钿胞数分别增至(2470.5 79.96)X103、(53.96 4.29)X100% (21.86 3.09)X100%; 20 卩 g/ml 是液体培养诱导骨 髓CD34 钿胞向粒系分化的最佳浓度，可使细胞总数、CFU-GM 和 CD33+田胞分别增至(133.2 9.03)X103、(26.78 1.91)X100%5 (16.98 1.73)X100% 甲基纤维素半固体培养检测显示，TSPG( 10-50 卩 g/ml

3、 )均能提高 CD34 钿胞 形成CFU-GM集落产率，以 TSPG 20 卩 g/ml 效果最为明显。结论：合适剂量 的 TSPG 能够促进 CD34 造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。【关键词】人参总皂甙；CD34 造血干/祖细胞；细胞扩增；细胞分化Synergistic Effects of Total Saponins of Panax GinsenginCombination with Hematopoietic Growth Factor on Proliferation and Differentiation ofCD34+ Cells Ex VivoAbstractTo i

4、nvestigate theeffects of total saponins of panax ginseng (TSPG)in combination with hematopoietic growth factors (HGF) on proliferation anddifferentiation of CD34+cells ex vivo, thepurified CD34+ cells from cord blood and bone marrow were expanded by variousconcentrations of TSPG with combination of

5、cytokines in liquid culture systems and theexpanded cell number, CD34+cellnumber, CD33+ cell ratio, the numbers of total CFC and hematopoietic progenitor cellnumber were detected. The resultsshowed that TSPG (10-70 卩 g/ml) could raise the expanded cell number, CD34+ cellnumber, and the numbers of to

6、tal CFC, TSPG 50卩 g/ml was identified as the most potent stimulatingconcentration,and increased total nucleated cells to(2470.5 79.96)X103 、 CFC to (53.96 4.286)X100% and CD34+ cells to (21.863.094)X100%; TSPG (10-50 卩 g/ml) could raise thecolony formationrate of CFU-GM, TSPG(20 卩 g/ml) induced the

7、besteffect on granulocytopoieticdifferentiation committed of CD34+cells. It is concludedthat the optimal concentration ofTSPG canpromote CD34+ cells to proliferate and differentiate by cooperating with hematopoieticgrowth factors.Key wordsTotal Saponins ofPanax Ginseng; CD34+ Cells; Proliferation an

8、d differentiation造血干/祖细胞的体外扩增和定向诱导分化是造血干细胞工程研究的关键课题，其研 究现状展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用潜力，同时也 为中医药现代化研究带来了新的切入点。人参是祖国传统医学的 补气 要药， 人参皂甙是人参中主要的有效药物成分。我们前期工作研究表明：人参总皂甙（TSPG 是人参促进血细胞生成的有效成分。 TSP（在体内外均能刺激造血干细胞（CFU-S 和造血祖细胞（CFU-GEMMCFU-E BFU-E CFU-GM 和 CFU-MK 的 增殖分化 1-3 。本研究将进一步采用造血细胞工程技术，以分离纯化的 CD34+HSC/HP为靶

9、细胞，探讨 TSPG 寸 CD34+HSC/HP 扩增及诱导分化为粒系血 细胞的作用，旨在阐述人参 补气生血 的现代生物学机理，为临床治疗血液学 疾病提供指导。材料和方法主要试剂RPMI 1640 与 IMDM 培养基购自美国 Gibco 公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，马血清（HS 由军事医学科学院提供，胎牛血清（FBS 购自 Sigma 公司。FL、TPO SCF 和 G-CSF 购自美国 Santa Cruz 公司，IL-3、GM-CS 和 EPO 由军事医学科学院提供。小 鼠抗人 FITC标记的 CD33 抗体购自 Santa Cruz 公司，小鼠抗人 FITC 标记的 CD34

10、 抗体购自美国Bection Dick in son 公司。StemsepTM 分选系统购自加拿大 StemCell Technologies 公司，流式细胞仪 FACS Vantage 购自美国 Bection Dickinson 公司。 药物人参总皂甙（ total saponins of panaxginseng，TSPQ 由重庆中药研究所惠赠，纯度 95%以上，用 IMDM 配成 1 mg/ml 的工作液，正压过滤除菌。细胞来源 正常骨髓细胞取胸外科无血液疾病患者切除的肋骨骨髓，淋巴细胞分离液（ Ficoll ，相寸密度 1?077） 分离单个核细胞 （MNC， 用 RPMI 1640

11、 培养液洗涤， 用 4 号针头制备单细胞悬 液， 并计数 MNC。脐血细胞取自足月妊娠正常分娩脐带血（重庆医科大学第一附属医院提供），采集按 Broxmeyer 报道方法进行，细胞在 12 小时内经 Ficoll（相对密度 1?077）梯度离心，制成 MN（悬液。CD34+HSC/HP 的分离纯化将（4-8）X107 骨髓、脐血 MN（悬浮于含 2%台牛血清的 PBS 缓冲液中，加入 antibody cocktail 100 卩 l，0C30 分钟，再加入磁性胶体 60 卩 l，0C30 分钟。采用 CD34 StemsepTM 分选系统，操作按说明书进行。将标 记后的骨髓、脐血MN（加入磁

12、场中的分离柱内，加缓冲液冲洗，从流出道收集 未标记的细胞群。离心洗涤后， 流式细胞仪 FACS Vantage （Becton Dickinson Immu no cytometry System, USA）检测分离 CD34+田胞纯度；采 0.1 ml 收集细胞 进行台盼蓝染色以鉴定细胞活力。TSPG 对 CD34 钿胞扩增影响液体培养检测 以含有 12.5% HS 12.5% FBS 5X103/ml 脐血 CD34+田胞的 IMDM 为基 础体系。对照组：在以上体系内加入 FL/TPO/SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF/EPO（FL、TPO SCF IL-3、GM-CSF G-

13、CSF 和 EPOK终浓度分别为 40、10、100、 2、50 和 20 ng/ml 及 2 U/ml ）重组细胞因子组合。TSPG 组：以对照组培养 体系为基础条件，加入不同剂量的 TSPG 终浓度分别为 10、20、50、70 和 100 卩 g/ml。细胞因子每 48 小时加入体系 1 次，均连续加入 5 次；TSPG 每周加入 1 次。上述体系接种于 24孔板中，每孔 1 ml，复种 3 孔，37C、5% CO2 及饱和 湿度下培养 18 天，每周半量换液，取出细胞用于细胞总数、CD34 钿胞比例及造血祖细胞检测。TSPG 对 CD34 钿胞分化影响的液体培养检测骨髓CD34+田胞培

14、养（细胞数、TSPG 浓度以及培养条件均同脐血细胞培养）体系中 加入重组细胞因子组合 SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF 培养时间为 2 周。每周半量 换液，取出细胞用于细胞总数、CD33 钿胞比例及 CFU-GM&细胞检测。CD34+ CD33 钿胞的检测将扩增的细胞经 PBS 洗涤后，用直接荧光法标记行流式细胞仪检测，每个样品分析细胞数 1X104,用 PC-Lysys II 软件在VAX33O0 微机（Digital , USA）上进行分析。造血祖细胞培养 体系中含 30% HS 10% BSA SCF IL-3、GM-CSF EPOS在此基础上分别加入5X103/ml

15、CD34+细胞、5X104/ml 扩增细胞，IMDM 及 0.9%甲基纤维素。所有 培养均在 96 孔板（每孔 0.2 ml，复种 3-5 孔）进行，37C、5% CO2 及饱和湿度 下培养 6天后计数 CFU-E 14 天计数 CFU-GEMMCFU-GM 和 BFU-E 其总数即集 落形成细胞总数（CFCoTSPG 对 CD34 细胞形成 CFU-GM 能力影响的甲基纤维素半固体培养检测 体系中含 30% HS、10% BSA、SCF、IL-3 、GM-CS、 F G-CSF及 5X103/ml CD34+细胞，IMDM 及 0.9%甲基纤维素。药物组为在 CD34+ 细胞培养体系中加入不

16、同剂量的 TSPG 剂量同前），以不加 TSPG 为对照组。所 有培养均在96 孔板（每孔 0.2 ml，复种 3-5 孔）进行，37C,5% CO2 及饱和湿 度下培养 14 天后计数 CFU-GM统计学方法显著性分析用 t 检验，PV0.05 为差异有显著性。 结果 CD34 钿胞的分选、纯化与鉴定 骨 髓、脐血 MNC 中仅有少量细胞表达 CD34 抗原，CD34+HSC/HP 仅占 1%-3%用 StemsepTM 系统分离纯化可得到高纯度的 CD34+田胞，经流式细胞术检测，其纯 度为 86%-92%台盼蓝拒染测定，CD34 钿胞活性为 95%-99%体外扩增细胞的形态学观察CD34

17、 钿胞经体外培养 18 天后，出现不同发育阶段的血细胞，形态各异（图 1）o百事通TSPG 协同细胞因子对细胞总数及 CFC 和CD34+田胞的扩增作用将 CD34 钿胞在液体培养中扩增，同时加入不同浓度的 TSPG 刺激培养 18 天。结果显示： 以原数为 100% FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/G-CSF/GM-CS 细胞因子组合可使细胞总数、CFC 和 CD34+田胞分别增至（2346.565.03）X103、 （ 42.565.61）X100%5（15.592?71）X100%TSPG 10-70 卩 g/ml 均可不同程度地提高细胞总数、CFCs 和 CD34 钿 胞数，T

18、SPG 50卩 g/ml 是最佳刺激浓度，可使细胞总数、CFC 和 CD34+田胞分别增至（2470.5 79.96）X103、（ 53.96 4.286）X100%5（21.86 3.094）X100% （表 1,图 2）。Table 1. Effect of TSPG on expa nsionof CD34+ cells from human cord blood （略）TSPG 诱导CD34+田胞定向分化为粒系血细胞的作用不同浓度的 TSPG 协同造血生长因子诱导 CD34 钿胞分化 2 周，结果显示：TSPG 10-70 卩 g/ml 均可不同程度地 提高细胞总数、CFU-GM 数及

19、 CD33 钿胞比例，TSPG 20 卩 g/ml 是液体培养诱导 CD34+田胞向粒系分化的最佳浓度，但 TSPG 100 卩 g/ml 则对细胞总数的增加有 所抑制，与对照组相比有显著性（表 2）oTable 2. Effect of TSPG on granucytopoietic differentiation ofpurified CD34+ cells derived from human bone marrow cells （略）TSPG 对 CD34 钿胞形成 CFU-Gh 能力的影响以甲基纤维素半固体培养法检测不同剂量 TSPG 诱导 CD34+HSC/HPICCFU-GMf

20、 殖能力，结果显示：TSPG（ 10-50 卩 g/ml ）能提高 CD34 钿胞形成 CFU-GM勺集落产率，以 TSPG 20 卩 g/ml 效果最为明显（Pv0.01 ）（表 3）。 Table 3. Effectof TSPG on the CFU-GM colony formation of CD34+ cells（略） 讨论从应用的角度出发，在较为圆满地解决了 CD34+田胞的体内动员和体外富集后，目前所面临的最大挑战是如何有效地在体外扩增所富集 的少量CD34+田胞，使其在既定的时限内既能增加其数量又能保证其质量，真 正达到临床应用的要求，这是当今生命科学极为关注的焦点。人们在努

21、力探索 各种方案以寻找解决这一问题的途径。人参是祖国传统医学的补气 要药，人参皂甙是人参中主要的有效药物成分。我们前期工作研究表明：TSPG 在体内外均能刺激造血干细胞（CFU-S 和造血祖细胞（CFU-GEMMCFU-E BFU-E CFU-GMffiCFU-MK 增殖分化。由此，我们构想将中药 TSPG 应用到造血干/祖细胞体 外扩增工程中，观察 TSPG 寸 CD34 造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用，期 望通过中医中药的应用途径来寻找克服这一难题的新视角。造血生长因子支持 的体外扩增是目前造血干/祖细胞体外扩增应用最为广泛的方法。TPC 是促进巨核细胞发育和血小板生成的细胞因子，但大

22、量的研究表明TPO 具有协同多系造血的活性4。FL 可诱导处于静止期的造血干/祖细胞进入增殖期，使它们对 早期造血细胞因子，如 SCF、IL-3 、IL-6 产生增殖反应 5， 6。更有意义的 是：在传统的细胞因子组合 SCF/IL-3/IL-6/G-CSF/EPO 扩增体系中同时加入 FL 和 TPO 两种细胞因子后，对早期造血祖细胞则表现出明显的协同扩增作用。FL/TPO/SCF/IL-3/IL-6/G-CSF 组合扩增 14 天后，细胞总数、 CFU-GM、CFU-MK 分别增加 2130 土 57、707和 118 土 11 倍，且 CD34+CD3 细胞扩增 465倍7。邱录贵和 R

23、oger8将 10 份脐血中富集的 CD34 钿胞接种于含 20% FBS 的IMDM 中，分别加入由 SCF FL 与 IL-1B、IL-3、IL-6、G-CSF EPO(合 称 136GE 组成的 3 组细胞因子(A:FL+136GE B： SCF+136G； C: FL+SCF+136GE 培养扩增 7天，C 组各项指标均显著优于前两组。这一结果提 示： FL 和 SCF 具有明显的协同效应；30%勺脐血标本在 FL/SCF/136GE 刺激 下经 7 天扩增可获得50X106 的 CD34钿胞，足够用于体重50 kg 的成人移 植造血干细胞；扩增后的 CD34 钿胞与扩增前的CD34+

24、田胞相比，基本保留了较 高的集落形成能力和体外扩增潜能。在我们的实验中，采用的细胞因子组合包括了早期造血生长因子( SCF、 IL-3 、 GM-CSF ，造血活存因子( G- CSF、系特异性生长因子(G-CSF EPO )以及 FL 和 TPO 应用FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/G-CSF/GM-CSF 与 CD34+田胞共培养 18 天，可使细胞总数 和CFC 分别增至(2346.5 65.03)X103 和(42.56 5.605)X100% CD34+ 细胞数也扩增(15.59 2.712)X100%以不同剂量的 TSPG 加入到含有FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/

25、G-CSF/GM-CSF 细胞因子组合的基础培养体系中， 刺激 CD34+田胞 18 天，结果显示 TSPG 10-70 卩 g/ml 不仅可以提高细胞总数，而且 也同样能提高CFC 和 CD34 钿胞数， 表明 TSPG 能够协同细胞因子促进 CD34 造 血干/祖细胞的增殖，而且也能促进早期造血祖细胞的扩增。对于TSPG 能否促进 CFU-GM 勺增殖，文献报道结论各异。黄干等1认为，TSPG 对小鼠 CFU-GM 的集落产率无明显影响；但王勇等 9同样以小鼠为实验对象，实验结果却表 明 TSPG对 CFU-GM 勺刺激作用与剂量有关，TSPG 在 3 卩 g/ml 浓度时对 CFU-GM

26、 的增殖的影响不明显，而当浓度增高到 20 卩 g/ml 时，CFU-GM 的集落产率明显 提高；高瑞兰等 10研究表明，人参皂甙能刺激正常人和再生障碍性贫血患 者 CFU-GMf 殖；我们直接以分离纯化的人骨髓 CD34细胞为靶细胞，探讨 TSPG 对 CD34 钿胞向粒系细胞分化的影响，观察到 TSPG 10-70 卩 g/ml 均可不同程 度地提高细胞总数、CFU-GMT增倍数及 CD33+田胞比例，TSPG 20 卩 g/ml 是液 体培养诱导 CD34 钿胞向粒系分化的最佳浓度。以甲基纤维素半固体培养法检 测不同剂量 TSPG 诱导 CD34+HSC/HP 向CFU-GMf 殖与分化

27、能力，结果显示 TSPG( 10-50 卩 g/ml )均能提高 CD34 钿胞形成CFU-GM 的集落产率，以 TSPG 20 卩 g/ml 效果最为明显。所以，我们认为 TSPG 能够协同其它细胞因子诱导 CD34+HSC/HP 向粒系细胞分化。【参考文献】1 黄干，祝彼得，张淑慎. 人参总皂甙对小鼠血细胞生成的影响 . 中华血液学杂志 , 1990 ； 11： 66-68 2 王璐，王亚平 . 人参总皂甙诱导人造血基质细胞表达 IL-3 的实验研究 . 解剖 学报， 2004；35： 49-543 王莎莉，陈笛，王亚平等 . 人参总皂甙对人 GM-CSF 和 GM-CSF 表达的调控.生理学报，2003; 55: 487-4924 裴雪涛，王立生， 徐黎等血小板生成素对 CD34 造血祖细胞的协