米醇溶蛋白及壳聚糖共混合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

1、www.CRTER.org李春亮，等. 米醇溶蛋白及壳聚糖共混合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响米醇溶蛋白及壳聚糖共混合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响李春亮1，秦 凤2，李林昌1，唐保明1，李钊伟1(青海大学附属医院，1骨科，2内分泌科，青海省西宁市 810000)引用本文：李春亮，秦凤，李林昌，唐保明，李钊伟. 米醇溶蛋白及壳聚糖共混合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响J.中国组织工程研究，2016，20(21):3071-3079.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.21.005 ORCID: 0000-0002-0165-911X(李钊伟)文章快速

2、阅读：玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化李春亮，男，1978年生，山东省郓城县人，2014年青海大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞基础研究和创伤骨科临床研究。通讯作者：李钊伟，副主任医师，副教授，青海大学附属医院骨科，青海省西宁市 810000中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)21-03071-09稿件接受：2016-03-08http:/WWW.壳聚糖含量从0%到100%的一系列玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜随着壳聚糖含量的增加，复合膜的拉伸强度、断裂伸长率、吸水率、亲水性增强评价其理化性能和细胞相容性评价成骨

3、诱导分化能力壳聚糖改善了复合膜的亲水性，有效促进了细胞黏附、生长及增殖在诱导液作用下，ZC-n复合膜能够诱导骨髓间充质干细胞分化成骨细胞，随着壳聚糖含量的增加，其促进分化的效果越明显 文题释义：玉米醇溶蛋白：来源于玉米，是一种天然蛋白，又称醇溶谷蛋白。据Mckinney分类，可将其分为-zein和-zein，其富含含硫氨基酸，可以形成较强的分子内二硫键，且与分子之间的疏水键一起构成了玉米醇溶蛋白成膜的分子基础。玉米醇溶蛋白具有良好的可降解性、无毒副作用和血液相容性，同时，还有促进骨组织再生的生物活性和易于血管化形成等特性，但是其存在力学性能差、细胞黏附性差及亲水性不足等缺陷。壳聚糖：是由甲壳素

4、经过脱乙酰作用而来，它是由-(14)-2-乙酰胺-2-脱氧-D-葡聚糖和少量的-(14)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖组成。一般呈白色或淡黄色半透明状固体，其分子结构为链状与纤维素相似，易结晶，具有优良的理化性质，良好的生物相容性和可降解性等优点，还具有可以改善其他材料的力学性能、亲水性和生物相容性等能力。摘要背景：有学者通过壳聚糖与玉米醇溶蛋白共混改性，制备了玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜，初步评价了其理化性能，表明壳聚糖在一定程度上改善了玉米醇溶蛋白的力学性能和亲水性能，由此，作者预期玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜具有良好细胞相容性，益于骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：探讨玉米醇溶蛋白/壳聚糖

5、复合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，探索其作为骨组织工程材料的可行性。方法：以60%醋酸为溶剂，通过共混和流延法制备玉米醇溶蛋白/壳聚糖(ZC-n)复合膜。采用傅里叶红外光谱分析、力学性能测试、吸水率及扫描电镜等方法来表征其结构与理化性能。利用体外细胞培养方法评价复合膜的细胞相容性。通过贴壁分离筛选法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞，利用扫描电镜、荧光标记、碱性磷酸酶测定等方法评价玉米醇溶蛋白壳聚糖复合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。结果与结论：随着壳聚糖含量的增加，ZC-n复合膜的拉伸强度得到提高，吸水率及亲水性得到增强；壳聚糖具有促进细胞黏附、生长和增殖的作用，即ZC-n膜表现出良好的

6、细胞相容性；ZC-n膜与骨髓间充质干细胞结合并将其诱导分化为成骨细胞，且随着壳聚糖含量的增加，其诱导分化的效果越明显；结果表明，玉米醇溶蛋白壳聚糖复合膜在骨组织工程领域中具有一定的应用潜能。关键词：生物材料；材料相容性；玉米醇溶蛋白；壳聚糖；骨髓间充质干细胞；生物相容性主题词：骨髓；间质干细胞；玉米醇溶蛋白；壳聚糖；生物相容性材料；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Li Chun-liang, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospit

7、al of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, ChinaCorresponding author: Li Zhao-wei, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, ChinaEffect of zein/chitosan composite membrane on

8、 the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsLi Chun-liang1, Qin Feng2, Li Lin-chang1, Tang Bao-ming1, Li Zhao-wei1 (1Department of Orthopedics, 2Department of Endocrinology, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China)AbstractBACKGROUND:

9、 Some scholars have prepared zein/chitosan composite membrane based on blending methods, and preliminary evaluation of its physical and chemical properties shows that chitosan partly improves the mechanical properties and hydrophilic properties of zein. Therefore, zein/chitosan composite membrane pr

10、esumably has good cytocompatibility, which is beneficial to osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.OBJECTIVE: To explore the effect of zein/chitosan composite membrane on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts and its feasibility as a bon

11、e tissue-engineered material.METHODS: With 60% acetic acid as solvent, zein/chitosan composite membrane was prepared by blending and casting method. The structure and physicochemical properties of the composite membrane were investigated by Fourier transform infrared spectroscopy, tensile testing, w

12、ater absorption testing and scanning electron microscopy. And the cytocompatibility of the membrane was evaluated by in vitro cell cufture. Besides, bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rat were isolated via adherence screening method, and the effects of the composite membrane on t

13、he osteogenic differentiation of these cells were observed by scanning electron microscopy, fluorescent labeling and alkaline phosphatase assay.RESULTS AND CONCLUSION: The tensile strength, water absorption and hydrophilicity of the films were improved with the chitosan increased; chitosan could pro

14、mote cell proliferation indicating the good cytocompatibility of the composite films. Moreover, osteogenic induction occurred in bone marrow mesenchymal stem cells cultured on the composite membrane, and with an increase of chitosan, the induction was promoted. In conclusion, zein/chitosan composite

15、 membrane can be applied widely in the field of bone tissue engineering.Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Zein; Chitosan; Biocompatible Materials; Tissue EngineeringCite this article: Li CL, Qin F, Li LC, Tang BM, Li ZW. Effect of zein/chitosan composite membrane on the osteogen

16、ic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(21):3071-3079.3077ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction玉米醇溶蛋白是天然植物蛋白，具有良好的可降解性、血液相容性和无毒副作用，同时还有促进骨组织再生的生物活性和易于血管化形成等特性，但是其存在力学性能差(易脆)、细胞黏附性差及亲水性不足等缺陷，需进一步改性才可能扩大其在生物材料领域的应用。壳聚糖是自然界

17、中惟一碱性多糖，具有优良的理化性质，良好的生物相容性和可降解性等优点，还具有可以改善其他材料的力学性能、亲水性和生物相容性等能力。有学者通过壳聚糖与玉米醇溶蛋白共混改性，制备了玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜，初步评价了其理化性能，表明壳聚糖在一定程度上改善了玉米醇溶蛋白的力学性能和亲水性能，由此，作者预期玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜具有良好细胞相容性，益于骨髓间充质干细胞的成骨分化1-3。基于以上理由，实验制备壳聚糖改性的玉米醇溶蛋白复合膜材料，评价复合膜的理化性能，重点评价其细胞相容性，研究其对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，为其应用于骨组织工程领域提供依据。1 材料和方法 Materials a

18、nd methods 1.1 设计 细胞-材料体外观察实验。1.2 时间及地点 于2015年7至10月在青海大学医学院动物实验室完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 选取4-6周龄SD大鼠20只，雌雄不限，体质量(68.7±5.52) g，购自青海大学医学院动物实验中心。1.3.2 试剂 -甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、青链霉素(Sigma)；高糖、低糖DMEM培养基(Hyclone)；抗坏血酸(青海中诺生物)；标准胎牛血清(Gibio)；二甲基亚砜(上海化学试剂有限公司)；磷酸盐缓冲液(青海中诺生物)；玉米醇溶蛋白(西宁市日月辰用辅料有限公司

19、)；壳聚糖(南通兴成生物制品厂)；胰蛋白酶(吉诺生物科技有限公司)；醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；氨水(青海中天化工责任有限公司)；其余试剂均为国产分析纯试剂。1.4 实验方法1.4.1 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的制备 以玉米醇溶蛋白和壳聚糖为主要原料，以醋酸为其溶剂，制备玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜。具体方法如下：将玉米醇溶蛋白与壳聚糖分别溶于60%的醋酸水溶液中，制备成3%的玉米醇溶蛋白醋酸溶液和3%的壳聚糖醋酸溶液，将上述两种溶液按一定的比例共混，室温下机械搅拌至完全溶解，经纱布过滤后于4 下以6 000×g速率离心脱气10 min，得到玉米醇溶蛋白/壳聚糖共混液。将共混液

20、倒入方形塑料平皿内，室温下静置12 h，然后转至 40 烘箱中干燥8 h，揭膜，再经流水冲洗，贴膜干燥，保存于干燥器中备用。样品编号为ZC-n，其中，Z 表示玉米醇溶蛋白(zein)，C表示壳聚糖(chitosan)；n表示玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜中壳聚糖所占含量百分比(n为0，10，30，50，70，90和100)。例如，当n=10时，表示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜中壳聚糖的原始固含量为10%。1.4.2 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的结构与理化性质 采用TNZ1-5700型傅里叶红外光谱仪记录膜表面的红外光谱图，扫描范围为4 000-600 cm-1。玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜经过液氮冷

21、冻(10 min)，折断，真空干燥后，将各样品的断面分别粘贴于铜台上，经离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电子显微镜观察其断面形态。加速电压为25 kV。将已真空干燥的复合膜切成1 cm×3 cm大小的膜片，称质量(m1)，浸入含有去离子水的玻璃容器中，室温静置48 h，小心取出，用滤纸吸去表面水分，称质量(m2)。吸水率(Q)按下式计算：Q=(m2-m1)/m1 × 100%，其中每个样品测3次，取其平均值。将已真空干燥的复合膜切成1 cm×3 cm大小的膜片，称质量(m1)，将其浸入到体积分数为75%乙醇溶液的玻璃容器中，室温静置24 h，用滤纸吸去表面乙醇溶液，再

22、置于真空干燥6 h，称质量(m2)。质量变化(Mloss)按以下式计算：Mloss=(m1-m2)/m1×100%，其中每个样品测3次，取其平均值。再取出浸泡后的复合膜经过液氮冷冻 (10 min)，折断，真空干燥后，将各样品的段面粘贴于铜台上，经离子溅射仪喷金镀膜后，用扫描电子显微镜观察其断面形态。加速电压为20 kV。将玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜裁制成10 cm×1 cm长条，将其装在含有饱和碳酸钾水溶液的干燥器内平衡7 d，样品在蒸馏水中浸泡1 h后测量的值则是相对湿态下的拉伸强度及断裂伸长率，按照GB4456-84标准用电子拉力机检测复合膜在K2CO3氛围下及浸泡蒸

23、馏水后的拉伸强度及断裂伸长率，拉伸速率为50 mm/min。每个样品测试3次以上，取平均值。1.4.3 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的生物学性能评价 依据ISO10993-5系列标准4，通过CCK-8 法评价玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的细胞相容性。1.4.4 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 参照文献5-6方法进行荧光显微镜观察和电镜观察及碱性磷酸酶测定。骨髓间充质干细胞分离培养：取4-6周龄SD大鼠经颈椎脱位法处死，乙醇浸泡10 min，取长骨(肱骨、股骨、胫骨)，剔除肌肉组织，在超净工作台内清洗3-5次，剪掉长骨两端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取5 mL冲洗液(

24、体积分数为3%胎牛血清+97%PBS)冲洗骨髓腔(两端冲洗)。收集液体至离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上清重悬细胞，以1×108 L-1细胞浓度接种于培养瓶中，加适量DMEM培养基，在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期，每3 d换液。当细胞生长至80%融合时胰酶消化、收集、离心，以1×108 L-1细胞浓度接种于培养瓶中。荧光标记：取出高压灭菌的样品，分别放入24孔细胞培养板中。加1 mL培养基于复合膜上，放入37 的CO2细胞培养箱中浸润4 h。将第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液1.6 mL(细胞浓度约2×107 L-1)，在复合膜表

25、面滴加细胞悬液200 L，并且在空白孔中加入同样浓度同体积的细胞作为阴性对照组，放入37 的CO2细胞培养箱中培养48 h。观察细胞贴壁情况，待细胞达到70%-80%融合后，将培养基换成成骨诱导液进行诱导，每3 d换液，共诱导21 d。将样品用PBS洗3次，将钙黄绿素溶解在二甲基亚砜中得到0.5 g/L的钙黄绿素溶液，取500 L钙黄绿素溶液滴加至样品上，37 下孵育 30 min，去除溶液用PBS漂洗3次，荧光显微镜观察。扫描电镜观察：取出高压灭菌的样品，分别放入24孔细胞培养板中，加1 mL培养基于复合膜上，放入 37的CO2细胞培养箱中浸润4 h。将第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液1.

26、6 mL(细胞浓度约2×107 L-1)，再在复合膜表面滴加细胞悬液200 L，在空白孔中加入同样浓度同体积的细胞作为阴性对照组，放入37 的CO2细胞培养箱中培养48 h。观察细胞贴壁情况，待细胞达到70%-80%融合后，将培养基换成成骨诱导液进行诱导，每3 d换液，共诱导21 d。将样品用PBS漂洗2次，再加入适量的2.5%戊二醛溶液于4 下固定过夜，然后用PBS漂洗2次，取出样品，用锡箔纸包裹并做好标记，置于液氮浸泡10 min，真空干燥、黏台、镀金后，用扫描电镜观察样品表面的细胞形态并照相。碱性磷酸酶测定：将ZC-n膜分别剪成0.2 cm× 0.2 cm的薄片，用锡

27、箔纸包裹并做好标记，于121 高压灭菌30 min后，分别放入96孔细胞培养板中。将第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液(细胞浓度约2×107 L-1)，每组5孔，每孔100 L细胞悬液接种于复合膜上，在空白孔中加入同样浓度和同体积的细胞作为阴性对照组，放入37 的CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，移去培养液，每孔再加入100 L成骨诱导液，每3 d换液1次，7 d后取出样品，吸去成骨诱导液，用PBS漂洗1次或2次，配制含NaHCO3(0.1 mol/L)的MgCl2溶液 2.0 mmol/L，用该溶液(50 mL)溶解对硝基酚磷酸二钠(0.062 g)制备成底物反应液，加

28、入上述96孔板中 (100 L/孔)，37 孵育1 h，当颜色变黄时，再加入终止液NaOH(0.1 mol/L)，静止5 min后，将上述反应终止液移至另一96孔板中，用酶标仪检测405 nm处的吸光度值。1.5 主要观察指标 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的结构与理化性质。玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的生物学性能。玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的能力。1.6 统计学分析 计量资料数据以±s表示，采用t 检验，用SPSS 17.0统计软件进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的结构与理化性质

29、2.1.1 傅里叶红外光谱分析(FTIR) 图1为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的表面红外光谱图。实验显示，随着壳聚糖含量的增加，酰胺和酰胺向高波数移动，其结果证明玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜形成了较强的氢键。2.1.2 扫描电镜观察断面结构 图2所示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜断面扫描电镜图片。纯的玉米醇溶蛋白(ZC-0)断面结构较为均一，随着壳聚糖含量的增加，断面上出现一些纹理结构和鳞片结构。这种较大鳞片状的断面结构，表明样品分子链之间相互作用增加，在拉伸或扭曲时不易断裂。2.1.3 吸水率 图3所示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的吸水率曲线。复合膜在0.5 h左右吸收水分快速上升，0.5 h后吸

30、收峰上升非常缓慢，8 h后膜吸水基本达到平衡。随着壳聚糖含量的增加，复合膜的吸水率增加进而达到平衡。达到平衡时，复合膜的吸水率从ZC-10的60%左右上升到了ZC-90的130%左右。2.1.4 复合膜在乙醇中的溶解率 图4所示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜在体积分数为75%乙醇中浸泡 24 h的失质量率。纯壳聚糖在乙醇中失质量率几乎为0%，即几乎无质量损失，而纯玉米醇溶蛋白在乙醇中失质量率接近100%，即完全溶解。图5所示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖膜在乙醇浸泡后的断面扫描电镜图。玉米醇溶蛋白以颗粒状在ZC-n复合膜中呈均匀分布。同时，随着壳聚糖含量的增加，孔隙逐渐减少且孔径变小。2.1.5 力学性

31、能测试 图6所示为玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜在饱和碳酸钾氛围平衡后和在水中浸泡后的拉伸强度和断裂伸长率。在饱和K2CO3 氛围下平衡1周后，随着壳聚糖含量从0%到100%，膜材料的拉伸强度从7.5%逐渐升至111.2%，而断裂伸长率则由1.2%缓慢升至35%。随着壳聚糖含量从0%到100%，拉伸强度在9.8%-28.9%之间，而断裂伸长率在1.5%-122.1%之间。这一趋势与饱和K2CO3氛围下平衡1周后力学性能趋势大致相同。2.2 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的生物学性能 表1 所示为经分离提纯的第3代骨髓间充质干细胞与ZC-n 复合膜的浸提液共培养1，3，5，7 d的细胞增殖活性与培养时间

32、的关系。经统计学分析，细胞与浸提液共培养第1天和第3天，样品ZC-n组的细胞增殖率与空白对照组差异无显著性意义，随着培养时间延长至第5天和第7天，所有样品组的吸光度值随之增加，其中第5天的ZC-0组(P=0.019)及第7天的ZC-0组(P=0.029)、ZC-10组(P=0.014)、ZC-90组(P=0.003)、ZC-100组(P=0.011)的细胞增殖率均高于空白对照组(P < 0.05)。2.3 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞成骨分化2.3.1 荧光标记 图7为骨髓间充质干细胞与ZC-n复合膜共培养后分化为成骨细胞的光镜图。在诱导组中，细胞数量随着壳聚糖含量的增

33、加而逐渐增多，这是由于含大量亲水基团的壳聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使该复合膜能有效地吸附蛋白质，进而增强了该膜的细胞黏附性。图8所示为骨髓间充质干细胞与ZC-n复合膜共培养后分化为成骨细胞的荧光图，在荧光显微镜下，钙黄绿素标记的细胞发绿色荧光。随着壳聚糖含量的增加，荧光强度相对增强，这是由于壳聚糖改善了复合膜的亲水性。2.3.2 扫描电镜观察结果 图9所示为骨髓间充质干细胞与ZC-n 复合膜共培养后分化为成骨细胞的扫描电镜图。非诱导组中细胞大部分呈梭形、圆形且表面较光滑，随着壳聚糖含量增加，细胞数量逐渐增多且无钙化结节现象。诱导组中，从ZC-0到ZC-100，其细胞出现堆积且形态铺展，体

34、积增大，尤其从ZC-50到ZC-100，出现钙化结节沉淀现象。而ZC-0至ZC-30效果不是很明显，可能是因为壳聚糖含量减少，导致复合膜亲水性减弱，从而减少了细胞的吸附。2.3.3 碱性磷酸酶含量 如表2所示，骨髓间充质干细胞与ZC-n复合膜共培养分化为成骨细胞后碱性磷酸酶含量的变化，随着壳聚糖含量的增加，非诱导组与诱导组的吸光度值均呈增加趋势，且诱导组的吸光度值均高于非诱导组，即差异有显著性意义(P < 0.05)。3 讨论 Discussion玉米醇溶蛋白(Zein)来源于玉米，是一种天然蛋白，又称醇溶谷蛋白。据Mckinney分类，可将其分为-zein和-zein7，其富含含硫氨基

35、酸，可以形成较强的分子内二硫键，且与分子之间的疏水键一起构成了玉米醇溶蛋白成膜的分子基础。该蛋白平均相对分子质量一般为25 000-45 000，分子呈棒状结构。玉米醇溶蛋白以其优良的成膜特性、可降解性、良好的稳定性及安全性决定了玉米醇溶蛋白具有广泛的应用。近年来，玉米醇溶蛋白在生物医药领域已得到广泛的应用。比如，Sousa等8探究了玉米醇溶蛋白(微观粒子)在药物运输方面的应用，将该蛋白粒子分别与四环素、吲哚美辛、阿莫西林相互作用，并利用核磁共振技术检测该蛋白粒子与3种药物的亲和力，结果发现该蛋白粒子具有显著的亲和力；另外，制备成药物释放载体，不仅可以延迟药物释放，而且不受胃酸破坏的同时到达作

36、用部位。玉米醇溶蛋白也可作为生物活性肽，用酶将玉米醇溶蛋白水解可获得抗氧化肽，这种多肽具有降血压、降血脂及抗癌等多种保健功能。由于玉米醇溶蛋白具有良好的生物相容性，可降解性及无毒副作用，因此满足生物材料的基本要求。例如，Salerno等9构建了聚己内酯/玉米醇溶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料，评估其在骨组织工程中的应用价值。结果显示，该支架材料具有较好的降解性能、力学性能、细胞黏附性(MG63细胞)，且该材料促进了成骨分化。同时，该蛋白在食品、化学工业等也有广泛的应用。从ZC-0(纯玉米醇溶蛋白)的红外光谱图可以看出，其含酰胺和酰胺的特征吸收峰分别为1 643 cm-1和1 520 cm-1，而

37、ZC-100(纯壳聚糖)则含有-OH、-NH2等官能团10。由于不同比例玉米醇溶蛋白和壳聚糖结合且在静电相互作用力下，酰胺和酰胺的吸收峰分别从1 643 cm-1和1 520 cm-1逐渐位移至1 651 cm-1和 1 581 cm-1。此外，壳聚糖出现1 148 cm-1吸收峰，且该吸收峰从1 148 cm-1位移至1 169 cm-1。壳聚糖提高了材料的亲水性，这是因为玉米醇溶蛋白含大量疏水性氨基酸，而含有大量亲水基团的壳聚糖将疏水性氨基酸基体包裹，使水分子更好的与材料结合，亲水材料可能有利于细胞黏附和生长。因此，可以改变壳聚糖含量来调节ZC-n复合膜的亲/疏水性，从而调节细胞在其表面的

38、黏附性和生长行为。玉米醇溶蛋白易溶解于乙醇而壳聚糖不溶解11，纯壳聚糖在乙醇中失质量率几乎为0%，即几乎无质量损失，而纯玉米醇溶蛋白在乙醇中失质量率接近100%，即完全溶解。在乙醇中，样品干质量的变化反映了原样品中玉米醇溶蛋白的含量，但是失质量率并不完全等于原样中玉米醇溶蛋白的固含量，这可能一方面因为制备时的样品损失(如：过滤、离心)，另一方面可能少量的玉米醇溶蛋白在此条件下与壳聚糖结合紧密，而没有完全从复合膜中溶解出来。例如，壳聚糖为50%的膜可能有部分玉米醇溶蛋白未溶解，而是与壳聚糖发生了较强的相互作用，这从ZC-50 的扫描电镜断面照片和力学性能可得到进一步证实。玉米醇溶蛋白以颗粒状在Z

39、C-n 复合膜中呈均匀分布。同时，随着壳聚糖含量的增加，孔隙逐渐减少且孔径变小。在饱和K2CO3 氛围下平衡1周后，随着壳聚糖含量从0%到100%，膜材料的拉伸强度从7.5%逐渐升至111.2%，而断裂伸长率则由1.2%缓慢升至35%。壳聚糖含量为90%时，力学强度达到最大值，这是由于纯壳聚糖强度较高12，干态较脆，表明玉米醇溶蛋白较均匀分布在壳聚糖中且达到一定的增强作用，使其力学强度甚至高于纯壳聚糖膜。样品在水中浸泡1 h后，其拉伸强度明显降低， 140120100806040200吸水率(%)0 10 20 30 40 501 800 1 600 1 400 1 200 1 000 800

40、时间(h)波数(cm-1)图3 ZC-n 复合膜的吸水率Figure 3 Water absorption of zein/chitosan composite membrane图注：随着壳聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的吸水率增加进而达到平衡。图1 ZC-n复合膜的表面红外光谱Figure 1 Surface infrared spectra of zein/chitosan composite membrane图注：随着壳聚糖含量的增加，酰胺和酰胺向高波数移动，表明玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜形成了较强的氢键。图2 ZC-n复合膜断面的扫描电镜照片Figure 2 Section

41、 of zein/chitosan composite membrane under scanning electron图注：随着壳聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜断面上出现一些纹理结构和鳞片结构，表明样品分子链之间相互作用增加，在拉伸或扭曲时不易断裂(放大倍数：上排×1 000；下排×5 000)。ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100100806040200溶解率(%)ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100图4 ZC-n复合膜的溶解率(乙醇)Figure 4 Dissolu

42、tion rate of zein/chitosan composite membrane in alcohol图注：纯壳聚糖在乙醇中失质量率几乎为0%，即几乎无质量损失，而纯玉米醇溶蛋白在乙醇中失质量率接近100%，即完全溶解。ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100图5 浸泡在体积分数为75%乙醇后ZC-n复合膜断面的扫描电镜照片(×1 000)Figure 5 Section of zein/chitosan composite membrane immersed in 75% alcohol (scanning electron microsc

43、opy, x1 000)图注：随着壳聚糖含量的增加，玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜的孔隙逐渐减少且孔径变小。图6 ZC-n 复合膜的拉伸强度和断裂伸长率Figure 6 Tensile strength and elongation at break of zein/chitosan composite membrane图注：随着壳聚糖含量从0%到100%，膜材料的拉伸强度从7.5%逐渐升至111.2%，而断裂伸长率则由1.2%缓慢升至35%。随着壳聚糖含量从0%到100%，拉伸强度在9.8%- 28.9%之间，而断裂伸长率在1.5%-22.1%之间。这一趋势与饱和K2CO3 氛围下平衡1周后力学

44、性能趋势大致相同。断裂伸长率(%)(%)拉伸强度断裂伸长率拉伸强度(MPa)壳聚糖含量 (%)干态拉伸强度断裂伸长率壳聚糖含量 (%)相对湿态拉伸强度(MPa)断裂伸长率(%)图7 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的光镜图(×400)Figure 7 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane under light microscope (×400)图注：细胞数量随着壳聚糖含量的

45、增加而逐渐增多，这是由于含大量亲水基团的壳聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使该复合膜能有效地吸附蛋白质，进而增强了该膜的细胞黏附性。非诱导组 诱导组 非诱导组 诱导组图8 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的荧光图(×400)Figure 8 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane by fluorescent labeling method (×400)图注：随着壳聚糖含量的增

46、加，荧光强度相对增强，这是由于壳聚糖改善了复合膜的亲水性。非诱导组 诱导组 非诱导组 诱导组图9 玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的扫描电镜图(×1 000)Figure 9 Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by zein/chitosan composite membrane under scanning electron microscopy (×1 000)图注：非诱导组中细胞大部分呈梭形、圆形且表面较光滑，随着壳聚糖含量增加，细胞数

47、量逐渐增多且无钙化结节现象。诱导组中，从ZC-0到ZC-100，其细胞出现堆积且形态铺展，体积增大，尤其从ZC-50到ZC-100，出现钙化结节沉淀现象。ZC-0 ZC-10 ZC-30 ZC-50 ZC-70 ZC-90 ZC-100非诱导组诱导组3079ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH断裂伸长率却显著上升。随着壳聚糖含量从0%到100%，拉伸强度在9.8%-28.9%之间，而断裂伸长率在1.5%-122.1%之间。这一趋势与饱和K2CO3氛围下平衡1周后力学性能趋势大致相同。在拉伸强度中，ZC-10、ZC-30 和ZC-50 的强度略低于纯

48、玉米醇溶蛋白，这可能是因为纯玉米醇溶蛋白比其他膜具有更好的耐水性。细胞毒性试验是评价生物医用材料安全性的方法之一12。CCK-8中的WST-8被细胞中的脱氢酶还原为水表1 骨髓间充质干细胞在ZC-n复合膜材料浸提液中培养的增殖活性 (±s，n=20，%)Table 1 Cell viability of bone marrow mesenchymal stem cells cultured in the zein/chitosan composite membrane extracts at different time points表注：与空白对照组比较，aP < 0.05。

49、ZC-n：Z表示玉米醇溶蛋白；C表示壳聚糖；n表示壳聚糖所占百分比。组别1 d3 d5 d7 d空白对照组100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00ZC-0107.82±9.25109.94±9.31113.56±9.87a114.62±10.12aZC-10105.12±9.17109.87±9.29110.56±9.62115.26±10.09aZC-3099.85±9.02101.25±8.96103.6

50、9±9.14101.69±9.13ZC-50102.36±8.93102.14±8.98102.35±8.96101.99±9.02ZC-70100.58±8.91101.18±8.94101.97±8.95103.15±9.04ZC-9097.98±8.89106.89±9.23107.12±9.67116.89±10.08aZC-100101.29±8.92103.68±9.18105.62±9.49114.96±

51、;10.04a表2 骨髓间充质干细胞结合材料诱导成骨后碱性磷酸酶含量变化 (±s，n=20，吸光度值)Table 2 Activities of alkaline phosphatase of bone marrow mesenchymal stem cells after indued by zein/chitosan composite membrane组别非诱导组诱导组空白对照组0.500±0.0321.72±0.11aZC-00.620±0.0430.890±0.062aZC-100.680±0.0420.880±0

52、.061aZC-300.660±0.0450.780±0.052aZC-500.790±0.0541.68±0.12aZC-701.12±0.092.25±0.19aZC-901.21±0.101.96±0.13aZC-1000.890±0.0782.69±0.21a表注：与空白对照组比较，aP < 0.05。ZC-n：Z表示玉米醇溶蛋白；C表示壳聚糖；n表示壳聚糖所占百分比。溶性的黄色甲臜，甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，可通过检测490 nm 处的吸光度值来反应细胞数量，因此CCK-

53、8是目前被用于检测细胞毒性的常用方法之一，具有重复性好、高灵敏度、操作简便等诸多优点。实验结果显示：随着培养时间延长，ZC-n复合膜的浸提液能促进细胞增殖，无毒副作用，且细胞数量随着壳聚糖含量增加而增多，因此玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜具有良好的细胞相容性。在非诱导组中，细胞数量随着壳聚糖含量的增加而逐渐增多，这是由于含大量亲水基团的壳聚糖改善了玉米醇溶蛋白的疏水性，使该复合膜能有效地吸附蛋白质，进而增强了该膜的细胞黏附性。实验结果显示，在成骨诱导液作用下，随着壳聚糖含量的增加，细胞堆积沉淀越为显著，尤其从ZC-50到ZC-100发现有明显的细胞铺展、堆积且形态不规则，可见结节沉积。此外，还发现

54、在不加诱导液情况下，ZC-100自身促进了骨髓间充质干细胞生长与增殖，同时也出现细胞堆积，这是由于纯壳聚糖有较强的亲水性，能有效促进细胞生长与增殖(快速)。随着壳聚糖含量的增加，荧光强度相对增强，这是由于壳聚糖改善了复合膜的亲水性。与非诱导组空白对照相比，诱导组空白对照的细胞出现堆积且荧光较强。实验显示，随着壳聚糖含量增加，细胞成集落生长且沉淀堆积尤为明显。非诱导组中，骨髓间充质干细胞大部分呈梭形、圆形且表面较光滑，随着壳聚糖含量增加，细胞数量逐渐增多且无钙化结节现象。诱导组中从ZC-0到ZC-100，其细胞出现堆积且形态铺展，体积增大，尤其从ZC-50到ZC-100，出现钙化结节沉淀现象。Z

55、C-0至ZC-30效果不是很明显，可能是因为壳聚糖含量减少，导致复合膜亲水性减弱，从而减少了细胞的吸附。在诱导液作用下，ZC-n复合膜与骨髓间充质干细胞结合并将其诱导分化为成骨细胞，且随着壳聚糖含量的增加，分化效果越为明显，尤其是ZC-n(n=50，70，90，100)分化效果显著。在骨髓间充质干细胞定向成骨分化中，碱性磷酸酶是成骨细胞表面的一种标志性酶，随着细胞分化程度增加，碱性磷酸酶表达增加。实验采用对硝基酚磷酸二钠作为碱性磷酸酶的反应底物，在碱性磷酸酶的作用下，释放出的对硝基苯酚(4-NPP)在碱性溶液中分子重排，可形成水溶性醌类产物(黄色)，且在405 nm处有吸收峰13-15。随着壳

56、聚糖含量的增加，非诱导组与诱导组的吸光度值均呈增加趋势，且诱导组的吸光度值均高于非诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，这是由于壳聚糖提高了复合膜的亲水性，易于蛋白质的吸附，从而促进细胞生长与增殖，在诱导液作用下，碱性磷酸酶表达逐渐增加。综上所述，实验制备了壳聚糖含量从0%到100%的一系列玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜，并表征了其结构和理化性能。结果表明，随着壳聚糖含量的增加，复合膜的拉伸强度增强，断裂伸长率增加，吸水率增强、亲水性增强。壳聚糖改善了复合膜的亲水性，有效促进了细胞黏附、生长及增殖，即ZC-n复合膜表现出良好的细胞相容性。在诱导液作用下，ZC-n复合膜与骨髓间充质干细胞结合并将其诱导分化成骨细胞，随着壳聚糖含量的增加，其促进分化的效果越明显。玉米醇溶蛋白/壳聚糖复合膜具有较好的力学性能、生物相容性以及具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的功能，有望作为生物材料应用于骨组织工程中。作者贡