生物工程 本科 基因实验

1、基因工程试验绿色荧光蛋白（GFP）在E·coliBL21中的表达前言绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光（第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置）。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需

2、依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。应用：1 GFP作为报告基因GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。2 GFP作为融合标签GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。3.作为生物传感器4. 检测pH 野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH。3.2.2 检测卤素离子 YFP（

3、H148Q）变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递17。5. 其他检测应用 另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂18。6. GFP在细胞生物学上的应用GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质，利用这一性质，可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测，或直接应用于定量分析。7.GFP在筛选方面的应用1） GFP用于细胞的筛选 基于GFP的荧光特性，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便，GFP在细胞筛选上得到应用广泛。2）.GFP用于药物的筛选 利用GFP对目的物进行标记

4、，追踪GFP，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物。一材料1.1试验仪器1.5mL离心管，0.2mLPCR管，1mL吸头，100uL吸头，10uL吸头，1mL移液器，100uL移液器，10uL移液器，电泳仪，三角瓶，试管，烧杯，量筒，记号笔，IPTG，氨苄青霉素，TAE缓冲液及其配制，琼脂糖凝胶板及其制备。1.2试验试剂大肠杆菌菌株：E. coli JM109；E. coli BL21质粒：pCAMBIA还有GFP基因，作为模板；pMD19-T克隆载体（T载体），用于PCR产物的克隆；pET21b大肠杆菌中的表

5、达载体，表达外源基因用。培养基：LB液体培养基，LB固体培养基。试剂：taqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，氨苄青霉素，限制性内切酶：EcoRI，HindIII；IPTG；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），大肠杆菌感受态（takala，大连宝生物公司）；琼脂糖，TAE buffer，PCR相关试剂：10Xbuffer，dNTP，Mg2+, H2O。二试验方法实验路线：用pCAMBIA载体作为模板-PCR扩增GFP基因- DNA电泳检测有无PCR产物-PCR产物和T载体连接-转化大肠杆菌JM109，涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜-含重组质粒（p

6、MD18T-GFP）阳性克隆的筛选-阳性菌株接种5mL LB液体试管-37C培养过夜-提质粒（质粒提取试剂盒）-酶切质粒（EcoRI/HindIII），同时将pET21b载体做同样双酶切-电泳观察-回收pET21b载体和GFP基因片段（胶回收试剂盒）-GFP和pET21b连接-转化大肠杆菌JM109，涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜-挑取阳性克隆-接种5mL LB液体试管，37C培养过夜-提质粒-转化大肠杆菌BL21-涂0.2mL菌液，IPTG和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜-此日在紫外线下观察结果，看是否有绿色荧光出现在大肠杆菌菌落上。2.1 PCR扩增GFP模板

7、（25ul）2.1.1在灭菌的PCR管里，依次加入：ddH2O 16.5µ l 10× PCR Buffer（含） 2.5µ l Mg2+ 0.5µ l dNTP（10mM） 2µ l引物 1µ l个模板DNA 1µ lTaq酶（5U/µ l） 0.5µ l总体积 25µ l2.1.2混合后按下面程序进行扩增 94 5min 94 45s 58 45s(30个循环) 72 1min30s 72 10min 4 2.1.3 GFP扩增引物：5端引物：CCGGAATTCGATGGTAGATCTGAC

8、 3' EcoR I3端引物：CCCAAGCTTTCACACGTGGTGGTG 3 Hind III2.2电泳取8µl采用1%琼脂糖凝胶电泳检查产物情况2.3和PMD-18T连接转化E.coliJM109挑选阳性克隆培养取5µlPCR扩增产物与大肠杆菌感受态混合均匀，在0吸附30分钟，在42热激30秒（大肠杆菌膨胀，细胞表面DNA进入细胞），再在0保温2-3分钟（使细胞收缩，防止进入细胞的DNA再出来），加入20µlLB培养基在37的温度条件下在摇床上震荡45分钟，取出一定量的培养物涂平板，培养12-16小时。2.4提质粒2.4.1取15毫升个过夜培养的菌

9、悬液,加入离心管中,12000rpm离心1分钟，尽量吸去上清。注意：如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加BufferP1,P2,N3的用量；可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高洗脱效率。2.4.2向留有菌体沉淀的离心管中加入250微升BufferP1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果细菌未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。2.4.3向离心管中加入250微升BfferP2,温和的上下颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解，此时菌液应变的清亮粘稠。所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中出现

10、基因组DNA污染。如果溶液未变的清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。2.4.4向离心管中加入350微升BufferN3，立即温和的上下颠倒4-6次，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意：BufferN3加入后应立即充分混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中和还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。2.4.5柱平衡：向已装入收集个管的吸附柱中加入200微升BufferPS，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.4.6将步骤4中所得上清液加入到已装入收集管的吸附中，注意不要析出沉淀，12000rpm离心

11、1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。2.4.7向收集管中加入600微升BufferPW，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。2.4.8重复步骤7。2.4.9将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底凉干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应。2.4.10将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50100微升BufferEB，室温放置数分钟，12000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20保存质粒.注意1)为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重

12、新加入到吸附柱中,重复步骤10.BufferEB在65-70水域预热，适当延长吸附和洗脱时间，可以增加提取效率。2)洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水作洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5，pH值低于7会影响洗脱效率。3）如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。2.5表达载体和目的蛋白的酶切酶切质粒（EcoRI/HindIII），同时将pET21b载体做同样双酶切。2.6胶回收试剂盒组成Dp209_02(50次)Dp209_-3(200次)平衡液LB30ml120 ml溶液胶PN50 ml2*100 ml漂洗液pw15 ml50 ml洗脱缓冲液EB15

13、 ml30 ml吸附柱CA250个200个收集管（2ml）50个200个说明书1份1份2.6.1将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切出多余部分），放入干净的离心管中，称取重量。注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。2.6.2向胶块中加入3倍体积BufferPG:当琼脂糖凝胶浓度2时，建议使用6倍体积BufferPG。2.6.3 50孵育10分钟，其间不断温和的上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。入股还有微解的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分，直至胶块完全溶解。2.6.4 柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200微升BufferPs，12000rpm离心2分钟，倒掉艘集管

14、中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.5.5将步骤3或步骤4中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉吸附柱中的废液，将吸附柱放回收集管中。2.6.6向吸附柱中加入650微升BufferPW,12000rpm离心1分钟，倒掉吸附柱中的废液，将吸附柱放回收集管中。2.6.7 12000rpm离心2分钟，倒掉吸附柱中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底凉干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应。2.6.8将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50微升BufferEB(pH8.5),室温放置2分钟，1

15、2000rpm离心2分钟，收集DNA溶液。-20保存DNA。注意：1）洗脱液的pH值对于洗脱效率哟很大影响。若用水作洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5。2）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重复步骤10。3）洗脱体积不应小于30微升，体积过少会影响洗脱效率。4）如果用TE脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。5）回收大于10kb的DNA片段时，BufferEB应在50水浴中预热，适当延长吸附和洗脱时间，可增加回收效率。2.7 重组质粒的构建2.7.1 jm109 和BL-21感受态细胞的制备1) 将04 保存的jm109和BL-21菌种分别接种

16、在LB液体培养基中37 下250 r/min过夜培养16 h 。2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 活化培养23 h至OD=0.30.5 。3) 取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 下5000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 下5000 r/min离心10 min。4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在20 冰箱内保存。2.7.1 感受态细胞的转化1)

17、取制备好的感受态细胞100 l，冰上解冻，均匀悬浮。2) 加入2 l酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。3) 42 水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。4) 加入200 l LB液体培养基，37 ，50-100 rpm振荡培养1 h。5) 取200 l悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。2.7.3 碱法提质粒1) 感受态细胞经转化培养后，平皿内有但菌落长出。2) 用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 , 180 r/min振荡培养过夜。3

18、) 取1.5 ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 、11000 r/min 离心1分钟，吸弃上清。4) 向离心管中加入150 ml用冰预冷的溶液，用微量移液器吹打重悬沉淀。5) 加入200 ml新配制的溶液 ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。6) 加入150 ml用冰预冷的溶液 ，轻轻混匀，冰上放置35分钟。7) 用微量离心机于4 、11000 r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。8) 加等体积氯仿400 ml抽提，振荡混匀，用微量离心机于4 、11000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。9) 吸取上清液300 ml，向上清中加入2倍体积的无水

19、乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4 、11000 rpm离心5分钟，弃上清。10) 用70%乙醇洗涤2次，再次4 、11000 rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。向已干燥的离心管内加20 ml超纯水溶解质粒DNA，加入2 ml 10 mg/ml RNA酶，37 处理1小时后于-20 贮存。2.7.4 酶切鉴定1) 取提取的质粒8 ml于另一微量离心管中，加入2 ml Bam H I和Not I的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。2) 离心，使溶液聚集在管底部。3) 37 ，酶切反应。2.7.5 琼脂糖凝胶电泳1) 称取0.8 g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100 mL 1

20、5;TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60 左右。2) 轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。3) 将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。4) 吸取10 ml的质粒与2 ml的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。5) 接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100 V, I=30 mA。6) 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。7) 在凝胶成像分析系统中观察结果。2.7.6 PCR-聚合酶链式反应1) 将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分PCR反应体系各成分

21、的量template0.1 mlP1(20 mM)0.2 mlP2(20 mM)0.2 mldNTPs(10 mM)0.4 mlTaqs(5 U/ml)0.2 ml10×PCR buffer2 mlddH2O16.9 mlTotal20 ml2) 将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性95 3 min，变性95 30 s，退火60-55 30 s，延伸72 1 min 10个循环，每个循环降0.5 。变性95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20个循环，72 延伸 2 min。3) PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。4) 取8 ml扩增后

22、产物，进行琼脂糖电泳检测。2.7.7 pET-21b-GFP重组质粒转化到大肠杆菌jm109 1) 取100 l感受态jm109，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 l经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。2) 42水浴热激70 s，冰上放置2 min。3) 加入200 l 含抗生素的LB液体培养基，37 ，60 r/min震荡培养30 min。4) 吸取200 l菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置12-16 h。2.8转化大肠杆菌BL21，重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导

23、表达。1) 挑选阳性克隆，取GFP重组菌接种于5 ml LB培养液(含Kana 100 mg/l)中，37 150-220 r/min过夜培养。2) 取100 l感受态BL21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。加入2 l经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。3) 42水浴热激70 s，冰上放置2 min。4) 加入200 l 含抗生素的LB液体培养基，37 ，60 r/min震荡培养30 min。5）吸取200ul菌液在涂有氨苄青霉素和IPTG培养基LB平板继续培养，37过夜. 4） 用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。三实验结果和分析在紫外灯的照射下，

24、培养基呈现绿色荧光。实验成功。参考文献1 梁国栋. 最新分子生物学实验技术 M . 北京: 科学技术出版社, 2001, 174.2 贾艳华，李国勋，张杰 荧光蛋白及其应用3 Katharine Sanderson 2008 年诺贝尔化学奖成果:绿色荧光蛋白(GFP)的研究分子植物育种 624 Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea J.

25、 J Cell Como Physiok, 1962, 59: 223-239.5 Brejck,Sixma TK,Kitts PPA,etal. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94:2306-2311. 6 Kain SR,AdamsM, Kondepudi A, et al. Green fluorescent p rotein

26、as a reporter of gene exp ression and p rotein localization. biotechniques, 1995, 19 (4) : 6507 Phillip s GJ. Green fluorescent p rotein - a bright idea for the study of bacterial p rotein localization. FEMSmicrobial Lett, 2001, 204 (1) : 98 ChalfieM, Tu, EKivchen G, et al. Green fluorescent p rotein as a marker forgene exp ression. Science, 1994, 263(5148) : 8029 ChalfieM. Green fluorescent p rotein. Photochem Photobiol, 1995, 62 (4) : 65110 Larrick JW, Balint RF, Youvan