工业微生物育种复习题 - 副本

1、 工业微生物育种知识点汇总1.1工业微生物：包括所有工业上应用的微生物，还包括一些工业生产中必须处理的杂菌。包括细菌、放线菌、单细胞藻类、酵母菌和其他真菌，以及通过各种人工手段改建的新细胞和动、植物的细胞培养物。1.2 工业微生物育种学：运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量1.3 工业微生物育种的目的: 消除不好的品性;加强好的品性;引入全新的特性.1.4 工业微生物育种方法：自然界中筛选分离；诱变育种；基因重组育种；重组DNA技术。 代谢调控育种 杂交育种 基因工程育种 分子定向育种 基因敲除育种1.5 Industr

2、ial microbial breeding science 工业微生物育种学2.1 基因型：由遗传信息组成，编码微生物的 所有特性。基因型代表潜在的特性，但并不是特性本身。2.2 表现型：指一些实际的、已表达的特性2.3 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程2.4 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。2.5 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。2.6 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。2.7 野生型：从自

3、然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。2.8 突变：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。而基因突变是在细胞学上看不到遗传物质的变化。2.9 转化：受体菌在自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因中，而获得部分新的遗传性状的基因转移的过程。2.10 转导：是以噬菌体为媒介将外源DNA片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。2.11 接合：在原核细胞中，细菌的接合是指细胞与细胞的相接触，遗传信息从供体细胞中转移到受体细胞中的过程。在真核细胞中，接合是指单倍体的配子融合成双倍体合子的过程。接合是通过性菌毛互相沟通,将

4、遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌.2.12 DNA的复制过程中，一个亲本双链DNA分子被转换成两个相同的子链DNA分子。其复制的关键是DNA碱基序列的互补结构。2.13 转录过程：起始位点的识别 ；转录起始 ；链的延伸 ；转录终止 ；转录后加工 2.14 蛋白质合成的过程：肽链合成的起始 ；肽链合成的延伸；肽链合成的终止与释放 ；合成多肽的输送和加工 ；蛋白质分子的折叠 2.15 诱变剂;凡能提高基因突变频率的因素.有化学诱变剂（碱基类似物诱变剂，例如：5-BU 2-AP等；与碱基起化学反应的诱变剂，例如：亚硝酸 各种烷化剂等；嵌入诱变剂，例如：原黄素，吖叮黄）物理诱变剂（辐射

5、和热，例如：紫外线 快中子等）生物诱变剂（转座因子） 2.16 诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。2.17 组成酶:是微生物细胞中经常存在的一类酶。组成酶的合成只受细胞内遗传物质的控制，与环境中的营养物质无关.2.18 碱基置换:DNA序列中一种碱基替换

6、另一种碱基导致突变。它包括两种类型：转换是由嘌呤置换嘌呤或嘧啶置换嘧啶。颠换是指嘌呤置换嘧啶或嘧啶置换嘌呤.2.19用操纵子学说阐明酶的诱导、酶的阻遏以及降解物阻遏的分子机制？RNA聚合酶的结合位点AZ结构基因（Z,Y,A）操纵基因启动基因调节基因DNA操纵子包括三类基因：启动基因来决定RNA聚合酶的结合位点，操纵基因来调控RNA聚合酶的启动或停止，结构基因来决定蛋白质的结构。调节基因用来编码阻遏蛋白。三个结构基因Z，Y，A分别编码三个酶，-半乳糖苷酶，通透酶和转酰酶。用大肠杆菌乳糖操纵子阐明酶的诱导： 当葡萄糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白会和操纵基因紧密结合，挡住了RNA聚合酶的去路，转录

7、不能启动，mRNA和酶不能合成。 当葡萄糖耗尽，只能利用乳糖时，乳糖成为诱导物，它与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白失去活性，不能再阻止转录的进行，结构基因开始转录为mRNA并进一步翻译成诱导酶。用大肠杆菌色氨酸操纵子阐明酶的阻遏 当阻遏蛋白不能与操纵基因结合时结构基因可以进行表达。大肠杆菌的代谢产物色氨酸能和阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化进而与操纵基因进行结合，结构基因不能表达。 用大肠杆菌乳糖操纵子阐明降解物阻遏的分子机制？ （ cAMP（环腺苷酸）能与CAP（分解代谢物活化蛋白）结合，促使RNA聚合酶与启动基因结合而开始转录。当 CAP-cAMP复合物减少，则不能与启动基因结合，故转录不得进

8、行） 当葡萄糖作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物降低了cAMP浓度，CAP-cAMP复合物也随之减少，RNA聚合酶与启动基因不能结合，故转录不得进行。2.20 如果碱基置换发生在读码阅读框（ORF）内，对蛋白质合成产生什么样的影响？非终止密码子置换为终止密码子，令肽链变短终止密码子变置换为非终止密码子，令肽链变长置换后的密码子对应同种氨基酸，对蛋白质合成没有影响置换后的密码子对应不同种类的氨基酸，所以可能形成与原来不同的蛋白质2.21 Replication 复制；Transcription 转录；Translation 翻译；Mutation（mutant）突变；Reverse translat

9、ion 逆转录；base-pair substitutions 碱基置换deletions or insertions 缺失或插入；Supplemented Medium补充培养基3.1 工业微生物应具备的特性：必须是纯培养物，不含有其它微生物和噬菌体；遗传稳定性好，可长期保存；易于产生大量的营养细胞，孢子或其他繁殖体，在种子罐和其他用于制备大量种子的容器中培养时能够茁壮、快速繁殖；菌株在较短时间，一般在3d或更短的时间内能快速产生目的产物，并很少产生毒性物质或副产物；菌株具有抵制其他杂菌感染和忍耐不良环境的能力，这种自我保护表现为pH值的降低，在较高的温度生长，或对高浓度代谢产物的忍耐力等；

10、对诱变剂敏感，可通过诱变达到提高菌种性能的目的。3.2 工业微生物来源：向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。6.1 怎样选择和采集含微生物的样品？根据土壤特点，从土壤中采样土壤有机质含量和通气状况5-25cm土层，适合微生物生长，酵母菌分布土层最浅，约510cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。土壤酸碱度和植被状况偏碱土壤环境，适合于细菌、放线菌生长。偏酸的土壤环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。植物根部的分泌物有所不同，即植被对微生物

11、分布也有一定的影响。地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。 季节条件冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。怎样从土壤中采样取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。或可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。将取好的土样混匀，取34g撒到试管斜面上。根据微生物生理特点采样根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需求和代谢类

12、型与其生长环境有着很大的相关性。如：森林土富含纤维素适合纤维素酶产生菌的生长根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如：海洋底部采样分离耐压菌6.2 富集培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。怎样选择和采集含微生物的样品，举例说明。一、 从土壤中采样1. 土壤有机质含量和通气状况2. 土壤酸碱度和植被状况3. 地理条件4. 季节条件二、根据微生物生理特点采

13、样1. 根据微生物营养类型森林土富含纤维素适合纤维素酶产生菌的生长；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中分离蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所分离产生淀粉酶、糖化酶的菌株。蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中筛选酵母菌。柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多果胶分离果胶酶产生菌2.根据微生物的生理特性筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火上爆发处及北方的堆肥中采样；海洋底部采样分离耐压菌；甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样分离耐高渗透压酵母菌。三、特殊环境下采样1. 局部环境条件的影响2.极端环境条件的影响简要说明含微生物样品的富集培养方法。富集培养是在

14、目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。 富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一、控制培养基的营养成分 微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。 在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基。二、控制培养条件 在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。 三、抑制不需

15、要的菌类 在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。试述从环境样品中分离与筛选蛋白酶菌的一般步骤及每步的目的及注意事项。从酱油中分离蛋白酶产生菌，肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中分离蛋白酶和脂肪酶产生菌；，一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基。大多数微生物都必须加入生长因子，生长因子可能是一种维生素，也可能是维生素、氨基酸和其他因子的复合体。通常在富集培养基中加入0.01-05

16、 g/L的酵母膏就能满足生长因子的需求。对于那些高度需要氨基酸的微生物，可用浓度高一些的富集培养基50-100 g/L。在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。通过控制营养和培养条件进行分离，排除不需要的菌类3.3 Separation 分离；Screening 筛选；Purification纯化；Ident

17、ification 鉴定4.1 诱变育种技术在育种工作的作用：提高目标产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件；开发新产品；给代谢调控育种提供技术手段4.2 影响突变率的因素： 菌种遗传特性不同菌体细胞壁结构环境条件的影响（诱变前预培养和诱变后培养；温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响；平皿密度效应）4.3 营养缺陷型：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。 4.5 野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。4.6 原养型：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的、

18、其营养要求在表型上与野生型相同的菌株。 4.7 完全培养基（CM）含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。4.8 基本培养基（MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。 4.9 补充培养基(SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基。试述营养缺陷型突变株选育的一般步骤及每步的目的及注意事项。三、试述营养缺陷型突变株选育的一般步骤及每步的目的注意事项(1)诱变处理 诱变剂处理出发菌株，诱发遗传物质改变（选择高剂量）（2）后培养 使突变基因稳定，纯合并表达，而且有利于消除表型延迟（3）

19、淘汰野生型 为了检出方便，大量淘汰野生型细胞，起到“浓缩”缺陷型作用（4）检出缺陷型 将缺陷型从群体中检出分离（5）营养缺陷型鉴定 确定该菌株是何种生长因子缺陷型（6）生产性能检测及高产菌株筛选：对所得到的菌株进行生产性能的测试，从中选出高产突变株前培养的目的： 对数中后期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱变剂敏感； 同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致； 细胞内应具有丰富的内源性碱基：DNA被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。 前培养的培养基：嘌呤、嘧啶碱基含量要丰富后培养：将诱变处理过的细胞在营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。 目

20、的：消除表型延迟 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。出发菌株 纯化、活化、前培养（同步培养） 培养液 离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 活细胞计数，致死率计算 后培养（中间培养） 平板分离 变异率计算 初筛复筛 保藏及扩大试验 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。遗传信息的载体是一系列为酶蛋白编码的核酸序列，如果核酸序列中的某碱基发生突变，由该基因所控制的酶合成受阻，该菌株也因此不能合成某种营养因子，使正常代

21、谢失去平衡。营养缺陷型菌株的分离和筛选营养缺陷型菌株的筛选一般包括诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类等步骤。1. 营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10%以上。后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟） 饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养46小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀2. 淘汰野生型菌株淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和

22、比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩 ，以利于检出。原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去 方法： 差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。 将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型不能萌发不被杀死。抗生素法： 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。 原理：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处

23、于休止状态的细菌。抗生素淘汰野生型的方法和步骤：（1）将诱变处理后的菌体用完全培养液振荡培养23代以 结束表型延迟现象，达到稳定的表型和生理状况。（2）饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养4-6小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”； （3）加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。（4）取样分别涂布MM和CM平板，菌落数差异大的浓缩效果较好。3. 营养缺陷型的检出限量补充法 MM+0.01%蛋白胨：野生型菌落大，缺陷型菌落小 ，此为限量法。如

24、果要筛选特定的营养缺陷型，可以在MM中加入少量的这种单一生长因子，此为补充法。 夹层培养法 制备琼脂平板： 培养：长出菌落后作记号 加第四层培养基：CM 培养：新长出的菌落多为缺陷型。4.营养缺陷型的鉴定通过营养缺陷型检出，仅仅了解突变体属于营养缺陷型菌株，只有通过鉴别测定，才能确定菌株属于哪一类营养缺陷型（如氨基酸类、维生素类、核酸类、碳源或氮源类以及无机盐类营养缺陷型等）或更具体的是缺陷哪一种营养因子（缺哪种氨基酸或哪种维生素）。6.5 试述高产突变株诱变选育的一般步骤及每步的目的及注意事项。出发菌株留档资料野生型出发菌株分离纯化、筛选斜面保存同步培养离心洗涤玻璃珠振荡打碎脱脂棉或者滤纸过

25、滤单细胞或孢子悬浮液诱变处理后培养平板分离初筛复筛分离、筛选保藏注意事项及目的：从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变高；在挑选出发菌株的时候，应挑选单倍体细胞，因为单倍体细胞可以看做是直接的配子，不易产生分离现象，可避免诱变后在筛选过程中出现隐形负突变之患，而直接淘汰不理想的突变体。培养生理活性一致的细胞的方法称为同步培养。它有两种方法：调整生理条件。将处在生长平衡期的细胞接到新鲜的培养基中，并将培养温度降至适宜温度一下。例如：细菌先在3下处理一小时后在升温至34培养，即可达到同步。机械或物理方法。用一定转速离心沉降就可以。我们要通过通过同步

26、培养，使细胞达到同步状态，又要在对数期，因为对数期的细胞生理活性最旺盛，突变率最高，呈现性也最好。若培养的是孢子（孢子一般为单核），处理时应力求孢子处于活跃期，可把孢子放在液体培养基上培养数个小时，以达到同步又使孢子处于活跃状态。离心洗涤两次，后用生理盐水或者缓冲液悬起。洗涤的目的是洗掉其菌体表面所带的培养基，用生理盐水等配制是为了减少在处理过程中pH 的大幅度变动。玻璃珠振荡打碎和脱脂棉或者滤纸过滤：都是为了将菌体分散，达到单细胞状态，保证菌悬液的浓度适宜。否则，如果几个细胞在一起，诱变时受的剂量不均匀，长出的菌落就会有几种状态的细胞，给筛选带来很大的麻烦，不能将真正的菌种筛选出来。由于遗传

27、的保守性，诱变某一菌种时不宜采用单一的诱变剂，可以换用物理和化学因素。此外，方法也应有变化，这可能打破遗传物质的保守性是有效地。因为遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经过复制才能体现，所以诱变后菌悬液必须经过后培养。后培养必须在含有足量的完全氨基酸或丰富的营养物质的培养基中才表现出高的突变率。-将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一只斜面，然后一个斜面的菌体接入一只锥形三角瓶，摇瓶培养，根据测定产物活性的高低，决定取舍。高产菌株概率愈低筛选菌落数量就越大，如果突变频率为1%，那么初筛挑选菌落起码要200个。复筛。按 1%接种量，将其分别接入到发酵培养基中，摇床

28、培养6.6 试述营养缺陷性突变株诱变选育的一般步骤及每步的目的及注意事项。营养缺陷型：是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。该菌株也因不能合成某种营养因子，使正常代谢失去平衡。野生型出发菌株分离纯化、筛选斜面保存同步培养离心洗涤两次诱变处理CM中摇瓶培养过夜用MM洗涤后在无氮的MM培养1-2小时加入500g/mL的青霉素涂平板CM后，摇瓶培养限量补充培养基检出法生长谱的确定注意事项及目的：营养缺陷型的筛选，一般诱变后都要经过中间培养，淘汰野生型，检出营养缺陷型和确定生长谱。为了减少以后筛选过程中再产生分离的混种现象，所以在缺陷性首次分离前，必须进行中间培养。中间培养的培养是完全培养基或

29、是补充培养基，培养过夜即可。中间培养后除有营养缺陷型，还有大量野生型菌株，为了以后筛选方便，需要浓缩营养缺陷型细胞，大量淘汰野生型细胞。浓缩前需要细胞耗尽所含的养料，所以用MM洗涤后在无氮的MM培养1-2小时青霉素的作用机制在于杀死正在分裂、正在合成新细胞壁的细菌。在MM培养基上野生型迅速生长，缺陷型被抑制，故大量生长的野生型菌被杀死。为了避免在处理期间由于细胞的自溶产生的营养物质促进缺陷型细胞生长，处理的细胞的浓度应限制在10 6个细胞/mL.为了防止野生型细胞的崩溃，采用了较高单位抗生素短时间处理方法。将菌液接种在含有0.01蛋白胨的MM上培养，野生型迅速生长成较大的菌落，而缺陷型将较慢的

30、长成小菌落，因而可以检出。经过缺陷型的检出，确定菌株为营养缺陷型后，就需要测它到底是什么缺陷型，这就是生长谱的确定。试述高产突变株诱变选育的一般步骤及每步的目的及注 意事项。经诱变处理产生的诱变一代,以M1表示.由于受射线等诱变因素的抑制和损伤,M1的发芽率、出苗率、成株率、结实率一般较低,发育延迟,植株矮化或畸形,并出现嵌合体.但这些变化一般不能遗传给后代.诱变引起的遗传变异多数为隐性,因此M1一般不进行选择,而以单株、单穗或以处理为单位收获.诱变二代(M2)是变异最大的世代,也是选择的关键时期,可根据育种目标及性状遗传特点选择优良单株（穗）.多数变异是不利的,但也能出现早熟、杆矮、抗病、抗

31、逆、品质优良等有益变异,变异频率约为0.0.2%.诱变三代（M3）以后,随着世代的增加,性状分离减少,有些性状一经获得即可迅速稳定.经过几个世代的选择就能获得稳定的优良突变系,再进一步试验育成新品种.具有某些突出性状的突变系,还可用作杂交亲本一、试述高产突变株诱变育种的一般步骤及每部的目的及注意事项1. 出发菌株的选择 目的：选择既往诱变史少的高产菌株 纯系菌株和对诱变剂敏感菌种 2. 诱变菌株的培养前培养 目的，将诱变细胞的生理状态调整到处于同步生长状态的旺盛的对数生长期而细胞内又含丰富的内源性碱基。3诱变菌悬液制备 目的：使细胞处于良好的分散状态。调节适当的细胞或孢子密度。 4诱变处理 目

32、的用诱变剂处理出发菌株，诱发遗传物质发生改变5后培养 诱变处理后，立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定，纯合并表达，而且有利于消除表型延迟6 高产突变株的分离与筛选 经过分离和筛选获得高产突变株。4.10 顺序反馈抑制：分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。4.11 同工酶的反馈抑制：同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻

33、止A转变为B4.12 协同反馈抑制：在分支代谢系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。4.13 累积反馈抑制：在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。4.14 超相加反馈抑制：超相加反馈抑制是一种既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。对一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑

34、制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。5.1 基因工程基本操作的四个步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定5.2 利用大肠杆菌为宿主进行基因工程育种时，外源蛋白的表达可采用那些表达方式？包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达5.3 基因工程菌遗传不稳定性的表现以及机制：重组DNA分子某一区域发生缺失、重排或修饰。整个重组DNA分子不稳定，从而使部分重组DNA分子子代细胞不带质粒。5.4 举例说明基因工程育种技术的应用情况重组人胰岛素生产重组人干扰素生产重组微生物工程菌与疫苗生

35、产重组微生物工程菌与食品、饲料工业重组微生物工程菌与环境保护5.5 影响微生物菌种稳定性的因素：变异污染死亡5.6 菌种衰退的表现：原有形态形状变得不典型；生长速度变慢；代谢产物生产能力下降；致病菌对宿主侵袭力下降；对外界不良环境的抵抗力下降。原因：根本原因在于基因自发突变；传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占了势；与培养条件有关5.7 常用的菌种保藏方法：7种常用方法 斜面冰箱保藏法半固体冰箱保藏法石蜡油封藏法甘油悬液保藏法沙土管保藏法冷冻干燥保藏法液氮保藏法 5.8 专利申请的基本要求：新颖性、创造性和实用性是专利申请能否授权的实质问题5.9 专利申请的一般步骤：1.专利申请文件的填写和

36、撰写；2确定申请日，申请号，受理通知书的获得；3.申请费的缴纳；4通过专利审批程序；6.对专利申请文件的主动修改和补正 ；7.答复专利局的各种通知书 ；9.办理专利权登记手续；10.办理登记手续应缴纳的费用5.10 退化(degenration ) ;复壮（rejuvenation）；染色体畸变（Chromosomal aberration）；转变（Transitions）；颠换（Transversions）；转化（Transformation）；转导（Transduction）；接合（Conjugation）6.4 试述从环境样品中分离与筛选石油降解菌的一般步骤及每步的目的及注意事项。基础培

37、养基：NH4NO3, 3g;K2HPO4, 1.5g，KH2PO4, 1.5;，NaCl , 0.5g，MgSO4·7H2O , 0.1g;CaCl2, 0.01g;FeCl2 ,0.01g;蒸馏水 1000mL，pH 7.0。选择培养基：基础培养液 1000mL+石油(1g)。营养培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 5g，NaCl 5g，琼脂 18g，水 1000mL，石油 1g，pH 值 7.0。 方法采样的注意事项：要在广阔的、分散的地点多采集样品。油井附近采样，选择 5个有代表性的样点（编号为），约510cm的土壤样品，混合均匀，装入无菌三角瓶中，尽快带回实验室，放入 4冰箱备用。

38、富集培养: 大多数微生物都必须加入生长因子，可能是一种维生素，也可能是维生素、氨基酸和其他因子的复合体。通常在富集培养基中加入0.01-05 g/L的酵母膏就能满足生长因子的需求。取一定量自然烘干的石油污染土样 5g 接入装有 50mL 选择培养基的 250mL 三角瓶中，于28、140r/min 条件下在摇床中富集培养 6d.然后取 2mL 的上述培养液接入装有 50mL 新鲜选择培养基的 250mL 三角瓶中，28、140r/min 条件下摇床中培养 6d；如此分别依次接种于含原油的选择培养基共筛选 3 次。初筛：筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通

39、气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。取经第三次培养的培养液，采 用10 倍递增稀释法对各土壤样品进行稀释，然后取104、105、106、107稀释液分别涂布于营养培养基平板，并将平板放置于恒温箱中37恒温培养 1 2 d。选择优势菌，挑取单菌落在营养培养基平板上划线；经多次划线纯化后，分离纯化得到的单菌落移至含机油的营养培养基斜面上培养保存。复筛：将小片无菌滤纸放入上述已涂石油的平板上，挑菌点在小滤纸片上，置 37 培养箱中倒置培养24 h 后，观察小纸片周围，颜色变淡的为石油降解菌1. 代谢调节(regulation of metablism）是指微生物的代谢速度和

40、方向按照微生物的需要而改变的一种作用2. 代谢调节方式:细胞透性的调节;代谢途径区域化;代谢流向的调控;代谢速度的调控1诱导根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。 诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。2阻遏 在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的类型主要

41、有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。3.末端代谢阻遏指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。4.分解代谢阻遏？指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。5.酶活性的调

42、节包括那些？及其影响因素？概 念：酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。调节方式：激活已有酶的活性；抑制已有酶的活性影响因素：底物和产物的性质和浓度；环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)；其他的酶的存在激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。反馈激活和前（体）馈激活示意图例1:糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶，例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物

43、的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用补充培养基：凡是只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为补充培养基（supplemental medium,SM）。它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成的。根据在基本培养基中加入的是A或B等营养因子代谢物而分别用 A 或 B 等来表示.抑制：由于某些物质的存在， 降低酶活性的现象。反馈抑制（feedback inhibition） ：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑 制。顺序反馈抑制（sequential feedback inhibition） 分支代谢途径中的两个末端产物

44、，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。同工酶的反馈抑制（isoenzyme feedback inhibition） 同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。协同反馈抑制（concerted feedback inhibition） 在分支代谢系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。累积反馈

45、抑制（cumulative feedback inhibition） 在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。超相加反馈抑制（cooperative feedback inhibition）超相加反馈抑制是一种既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。对一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。简述提高次级代谢产

46、物产量的方法1使用诱导物；2除去诱导物选育组成型产生菌；3降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；4解除分解代谢阻遏筛选抗分解代谢阻遏突变株；5解除反馈抑制筛选抗反馈抑制突变株；6防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；7改变细胞膜的通透性 ；8筛选抗生素抗性突变株 ；9选育条件抗性突变株 ；10调节生长速率；11加入酶的竞争性抑制剂 杂交过程中常用的培养基？各培养基有哪些特点杂交过程中常用的培养基有完全培养基（CM）、基本培养基（MM）、有限培养基（LM）和补充培养基（SM）。完全培养基，是一种营养成分复杂而丰富的培养基。其主要原材料都来自于天然有机物。在杂交育种过程中利用它和基本培养基

47、配合来检出重组体。基本培养基，是营养成分简单而贫乏的一种培养基。其配制的原材料基本上都是无机化合物。在杂交育种过程中相当重要，不论是营养缺陷型的筛选，还是重组体的检出、鉴别都是不可缺少的一类培养基。有限培养基，是专供异核体菌株生长使用的培养基。通常在基本培养基或蒸馏水中加入适量（10%20%）的完全培养基，加入的量只限两直接亲本菌株稍许生长，以提供相互接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多，会影响异核体菌株的检出。. 微生物杂交育种的基本环节是什么？各环节应注意什么？微生物杂交育种一般程序：选择原始亲本 诱变筛选直接亲本 直接亲本之间 亲和力鉴定 杂交 分离到基本培养基或选择性培养

48、基培养 筛选重选体 重组体分析鉴定。杂交育种的遗传标记（一）营养缺陷型标记（二）抗性标记（三）温度敏感标记（四）其它性状标记准性生殖在菌丝体生长过程中，两个不同遗传类型的菌丝细胞接触融合，形成异核体、杂合二倍体、最后经染色体相互交换，产生一个具有新遗传特性的菌株，称为准性繁殖。霉菌杂交的原理霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组和分离现象，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中，然后通过筛选出具有新遗传结构和优良遗传特性的新菌种。原生质体融合(protoplast fusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。 原

49、生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。与常规杂交相比，原生质体融合具有的优势：大幅提高亲本间的重组频率扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换、遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。影响原生质体制备的因素有哪些？培养基的影响:培养方式的影响菌龄对原生质体制

50、备的影响菌体浓度对原生质体制备的影响 酶系和酶浓度对原生质体制备的影响酶解时间对原生质体制备的影响温度对原生质体制备的影响pH值对原生质体制备的影响缓冲液和稳定剂对原生质体制备的影响酶解方式对原生质体制备的影响影响原生质体再生的因素有哪些？培养基对原生质体再生的影响稳定剂对原生质体再生的影响酶解浓度和时间对原生质体再生的影响再生方式对原生质体再生的影响原生质体密度对原生质体再生的影响其它因素对原生质体再生的影响原生质体融合育种的一般程序？各环节应注意什么？所谓原生质体融合， 就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁， 使之形成原生质体， 然后在高渗的条件下混合， 并加人物理的或者化学的或者生物

51、的助融条件， 使双亲株的原生质体间发生相互凝集， 通过细胞质融合， 核融合， 而后发生基因组间的交换重组， 进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来， 从而获得重组子的过程。 简述微生物基因组改组和改组育种技术的原理？基因组改组概念基因组改组的概念从 DNA 改组( DNA shuffling)的概念引申而来， 它是指以原生质体融合为手段， 在全基因组水平上对多个基因组进行随机重组， 进而创造出新基因组的过程。它既有 DNA 改组能进行多亲本杂交的特点， 也具有传统杂交育种可在全基因组水平重组的优势， 因而也是一种表型改造的组合方法。基因组改组技术基本原理-微生物细胞的快速定向进化基因组改

52、组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株1. 简述基因工程育种的原理和基本步骤。2. 1.从能产生有用产物的微生物中将相关的基因分离出 来，再导入到其他便于操作的基因工程常用微生物中，使其具有产生和高产相关产物的能力。3. 2. 直接对

53、工业生产菌株进行基因改造使其生产性能进一步改进。4.基因工程基本操作的四个步骤：1. 目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定步骤：1、目的基因的获得（DNA片段的获得） 2、载体的选择与准备 3、重组体DNA（DNA片 段和载体的连接） 4、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库 5、目的基因的表达和重组体的筛选1. 简述分子定向进化育种的原理？定向进化是近20年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因

54、进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。定向进化：是指在试管中进行的“分子进化”，即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽，也可以是核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。通过人工合成或借助于重组DNA技术，人为地制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力；或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来。2. 理性定向进化育种利用哪些技术手段，各有何特点？寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸定向诱变 该方法于上世纪70年代末建立,将目的基因克隆

55、到噬菌体M13单链表达载体上,然后合成一段在靶位点处含突变寡核苷酸的引物,使其与目的基因配对,再加入四种dNTP和Klenow DNA聚合酶,使寡聚核苷酸引物延伸成全长基因,获得的重组双链DNA分子转染细菌后大量复制,进而筛选出阳性突变子。PCR介导的定点突变 (1)突变引物诱变 当靶位点位于基因两端时,可设计这样一对引物扩增目的基因,正向引物为靶位点突变的兼并引物,反向引物为目的基因序列引物。突变引物诱变是基于PCR的点饱和突变中最简单、最快速的方法,但难以对基因中间的靶位点进行点饱和突变。(2)重叠延伸PCR 设计一对简并引物,使其在靶位点附近有一定程度的重叠(图2中的B、C引物),分别与基因5和3端引物(图2中的A、D引物)组合,扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段,然后将上下游片段在靶位点处交错,互为模板重叠延伸成全长基因。（3）质粒扩增诱变在靶位点处设计一对反向兼并引物,扩增质粒全长片段,然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本链,新合成链由于没有甲基化位点而被保护。 由于此法需要扩增质粒全长序列,因此在PCR反应中应特别注意扩增的保真性,一般采用高保真型或混合型耐热DNA聚合酶。盒式突变该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒(