2第二章DNA的分子特性

1、一、核酸的分子结构一、核酸的分子结构二、二、dna的变性和复性的变性和复性一、核酸的分子结构一、核酸的分子结构一）核酸的化学成分二）dna的一级结构三）dna的二级结构四）dna结构的多态性1）核酸是由什么组成的？）核酸是由什么组成的？ 核酸是生物体内的高分子化合物。核酸是生物体内的高分子化合物。核苷酸核苷酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,dna）核糖核酸核糖核酸（ribonucleicacid,rna） dna和rna都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的。含氮有机碱含氮有机碱(称碱基称碱基)戊糖戊糖磷酸磷酸嘌呤嘌呤：、：、嘧啶嘧啶：

2、、：、一）核酸的化学成分碱基结构图戊糖戊糖:rna中是中是d核糖核糖，dna中是中是d2脱氧核糖脱氧核糖糖苷键的连接都是糖苷键的连接都是构型构型。 核苷nucleoside 核苷酸(nucleotide) 核苷的磷酸酯核苷的磷酸酯 核酸分子的结构单元核酸分子的结构单元 3核苷酸核苷酸 5核苷酸核苷酸 5磷酸腺苷的结构式磷酸腺苷的结构式2）核苷酸是怎么连接的？3，5 - 磷酸二酯磷酸二酯寡核苷酸（oligonucleotide) 指二指二十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段成的线性多核苷酸片段。 使用时，对核苷酸残基的数目并无严格规定 寡核苷酸目前

3、已可由仪器自动合成，作为dna合成的引物（primer)、基因探针（probe)等 3）核酸链的简写式表示的主要内容是核酸链中的核苷酸或碱基 两种常用的简写式字符式字符式线条式线条式（1）字符式）字符式 英文大写字母英文大写字母缩写符号缩写符号 碱基碱基 小写英文字母小写英文字母p 磷酸残基磷酸残基 糖基、糖苷键和酯键等均糖基、糖苷键和酯键等均省略不写省略不写 碱基和磷酸相间排列碱基和磷酸相间排列例：例：dna链和链和rna链片段的简写式链片段的简写式 5ppppppppp3dna5ppppppppp3rna可进一步简化为： 5p35p3若若5端不写端不写p，则表示，则表示5末端为自由羟基。末

4、端为自由羟基。 双链双链dna分子的简写式分子的简写式 省略磷酸残基，同时再增加一条互补链；省略磷酸残基，同时再增加一条互补链； 链间的配对碱基用短纵线相连或省略；链间的配对碱基用短纵线相连或省略； 错配碱基对错行书写在互补链的上下两边。错配碱基对错行书写在互补链的上下两边。53355c（错配）（错配） （2）线条式）线条式 垂线垂线（位于碱基之下）（位于碱基之下） 糖基糖基 斜线斜线（位于垂线与之间）（位于垂线与之间） 磷酸酯键磷酸酯键简写式表示的含义简写式表示的含义核酸分子的核酸分子的一级结构一级结构核酸分子中的核苷酸排列顺序核酸分子中的核苷酸排列顺序 1）dna一级结构的概念一级结构的概

5、念dna分子中核苷酸的排列顺序分子中核苷酸的排列顺序，又称，又称碱基顺序碱基顺序5335如：二）dna的一级结构 生物遗传信息生物遗传信息：包含在碱基排列顺序中；：包含在碱基排列顺序中； 基因：基因：dna分子中不同排列顺序的分子中不同排列顺序的dna区段区段构成特定的功能单位；构成特定的功能单位；不同基因的功能各异，各自分布在不同基因的功能各异，各自分布在dna的一的一定区域；定区域； 基因的功能取决于基因的功能取决于dna的一级结构的一级结构。2）dna物理图谱物理图谱 dna链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶链的限制性酶切片段的排列顺序，即酶切片段在切片段在dna链上的定位链上的定位。

6、限制性内切酶识别限制性内切酶识别dna内内特异序列特异序列 核苷酸序列不同，酶切图谱也不同核苷酸序列不同，酶切图谱也不同 dna物理图谱是物理图谱是dna分子结构的特征之一分子结构的特征之一5335co1）dna双螺旋结构的主要依据双螺旋结构的主要依据 （1）50年代初的核酸研年代初的核酸研究现状使人们普遍接受的究现状使人们普遍接受的观点：观点：多核苷酸的特定序多核苷酸的特定序列是遗传信息所在列是遗传信息所在。 三）dna的二级结构 （2）组成组成dna的四种碱基的比例关系的四种碱基的比例关系1949-1951年间，年间，chatgaff应用紫外分光光度法结合纸应用紫外分光光度法结合纸层析等技

7、术，对不同来源的层析等技术，对不同来源的dna进行了碱基定量分析：进行了碱基定量分析：dna 来源 腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶(a+t) /(g+c)大肠杆菌25.424.824.125.71.01小麦26.828.023.222.71.21鼠29.725.621.922,81.21猪:肝 胸腺 脾29.430.029.629.728.929.220.520.420.420.520.720.81.43酵母31.332.918.717.11.079chatgaff 对对dna碱基组成的研究结果碱基组成的研究结果a、以摩尔含量表示，、以摩尔含量表示， a=t和和c=g；b、 不同物种组织不同物种组

8、织dna总碱基组成上有很大变总碱基组成上有很大变化，表现在化，表现在a+t/g+c比值的不同，但同种生物比值的不同，但同种生物的不同组织的不同组织dna碱基组成相同；碱基组成相同； c、嘌呤碱基的总和与嘧啶碱基的总和相等。、嘌呤碱基的总和与嘧啶碱基的总和相等。 (3)wilkins及其同事及其同事franklin等用等用x射线衍射线衍射方法获得的射方法获得的dna结构资料结构资料 高度定向高度定向dna纤维晶体纤维晶体 dna结构螺旋周期性结构螺旋周期性碱基的空间取向碱基的空间取向2）dna双螺旋结构的要点双螺旋结构的要点(1)主链主链(backbone)(2)碱基对碱基对(base pair

9、) 碱基位于螺旋的内则碱基位于螺旋的内则以以垂直垂直于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链于螺旋轴的取向通过糖苷键与主链糖基相连糖基相连 同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对 配对碱基总是配对碱基总是a与与t和和g与与c。碱基对以氢。碱基对以氢键维系，键维系，a=t ，g = c。 (3)大沟和小沟：大沟和小沟：小沟位于双螺旋的互补链之间，小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之间。而大沟位于相毗邻的双股之间。(4)结构参数：结构参数：螺旋直径螺旋直径2nm；螺旋周期包含；螺旋周期包含10对碱对碱基；螺距基；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距；相邻碱基

10、对平面的间距0.34nm。 3）dna双螺旋结构与双螺旋结构与dna复制复制l 双螺旋结构模型能够圆满地解释作为遗传功能分双螺旋结构模型能够圆满地解释作为遗传功能分子的子的dna是如何进行复制的；是如何进行复制的；l 半保留复制机制半保留复制机制(semi-conservative replication)。 是生物体遗传信息传递的最基本方式是生物体遗传信息传递的最基本方式 电镜下的电镜下的dna复制复制四）四）dna结构的多态性结构的多态性 atson和和crick以在生理盐溶液中抽出的以在生理盐溶液中抽出的dna纤维在纤维在92相对湿度相对湿度下进行下进行x射线衍射射线衍射图谱图谱得出的得

11、出的dna称称b构象构象。 研究表明研究表明dna的结构是动态的的结构是动态的 a构象构象：以钠、钾或铯作反离子，相对湿度为：以钠、钾或铯作反离子，相对湿度为75时，时，dna分子的分子的x射线衍射图。射线衍射图。 出现于脱水出现于脱水dnadna中中 出现于出现于dnadnarnarna杂交分子中杂交分子中 c构象构象：以锂作反离子，相对湿度进一步降为：以锂作反离子，相对湿度进一步降为66，dna分子的分子的x射线衍射图。射线衍射图。 仅在实验室中观察到仅在实验室中观察到 d和和e构象构象：相对湿度进一步下降，同时：相对湿度进一步下降，同时dna分分子中子中g-c碱基对较少的碱基对较少的x-

12、衍射图。衍射图。不同构象不同构象dnadna的共同特点的共同特点 都是右手双螺旋都是右手双螺旋 两条反向平行核苷酸链通过两条反向平行核苷酸链通过watson-crickwatson-crick碱基配对结合在一起碱基配对结合在一起 链的重复单位是链的重复单位是单核苷酸单核苷酸 都有都有两个螺旋沟两个螺旋沟，即大沟与小沟，即大沟与小沟cgcgcg单晶的单晶的x射线衍射图谱研究射线衍射图谱研究 左手左手双螺旋双螺旋 主链中各个磷酸根呈主链中各个磷酸根呈锯齿状锯齿状排列排列 如如“之之”字形一样，称为字形一样，称为z z构象构象 重复单位：重复单位：二核苷酸二核苷酸 只有一个螺旋沟只有一个螺旋沟 zd

13、na的形成的形成dna单链上出现单链上出现嘌呤嘌呤与与嘧啶嘧啶交替排列交替排列所成。所成。嘌呤碱是顺式的嘌呤碱是顺式的嘧啶碱是反式的嘧啶碱是反式的嘧啶糖苷链向外挑出嘧啶糖苷链向外挑出嘌呤糖苷键弯向小沟嘌呤糖苷键弯向小沟z zdnadna主链呈锯齿状或主链呈锯齿状或“之之”字形字形 zdna生物学意义？生物学意义？ zdna的形成通常在的形成通常在热力学上是不利的热力学上是不利的。 静电排斥静电排斥 解链位点解链位点与基因调节有关与基因调节有关沟的特征在其信息表达过程中起关键作用沟的特征在其信息表达过程中起关键作用zdna中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白

14、识别方式也发生变化式也发生变化pdnadna二级结构多态性的发现拓宽人二级结构多态性的发现拓宽人们的视野们的视野p生物体中最为稳定的遗传物质可生物体中最为稳定的遗传物质可以采用不同的姿态来实现其丰富多以采用不同的姿态来实现其丰富多采采 dna构象的可变性二、dna的变性和复性一）dna的变性 二）dna的复性 三）核酸分子杂交 变性变性(denaturation)和复性和复性(renaturation) u 是双链核酸分子的两个重要物理特性。是双链核酸分子的两个重要物理特性。u 是核酸研究中经常引用的术语。是核酸研究中经常引用的术语。u 双链双链dna、rna双链区，双链区，dna: rna杂

15、种双杂种双链链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子以及其它异源双链核酸分子(heteroduplex) 都具有此性质。都具有此性质。 一一) dna) dna的变性的变性 指指dna分子由稳定的双螺旋结构松解为分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象无规则线性结构的现象。n本质：本质：氢键氢键和和疏水键疏水键断裂断裂n部分的或全部的部分的或全部的n可逆的或非可逆的可逆的或非可逆的n不涉及到其一级结构的改变不涉及到其一级结构的改变 变性变性dna dna 的理化及生物学性质的理化及生物学性质溶液粘度降低溶液粘度降低溶液旋光性发生改变溶液旋光性发生改变增色效应或高色效应增

16、色效应或高色效应dna的增色反应 破坏双螺旋稳定性的因素破坏双螺旋稳定性的因素 加热加热 极端的极端的phph 甲醇甲醇 乙醇乙醇 尿素尿素 甲酰胺甲酰胺 热变性使热变性使dna分子双链解开所需温度分子双链解开所需温度 ( melting temperature)很狭很狭的温度范围内突发的跃变过程的温度范围内突发的跃变过程熔解温度（tm） 不同来源不同来源dna间的间的tm存在差别的原因存在差别的原因（a）dna的均一性的均一性dna分子中碱基组成的均一性分子中碱基组成的均一性 待测样品待测样品dna的组成是否均一的组成是否均一(b) dna的的(g+c)含量含量 (g+c)含量越高，即含量越

17、高，即g-c碱碱基对越多，基对越多，tm值越高。值越高。 tm与与(g+c)含量含量(x)百分数百分数的关系可用以下经验公式表示的关系可用以下经验公式表示(dna溶于溶于0.2mol/l nacl中中)： x%(g+c)=2.44(tm69.3)dna的tm值与g-c含量的关系 离子强度低，离子强度低，tm值低，融点范围宽值低，融点范围宽离子强度增高，离子强度增高，tm值增高，融点范围变窄值增高，融点范围变窄dna制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在保存在1mol/ nacl溶液中较稳定。溶液中较稳定。 （c）溶剂的性质）溶剂的性质二二) dn

18、a的复性的复性 指变性指变性dna 在适当条件下，两条互补链全部或在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。部分恢复到天然双螺旋结构的现象。 是变性的一种是变性的一种逆转过程逆转过程 经经缓慢冷却缓慢冷却即可复性，又称为即可复性，又称为“退火退火”热变性过程和两种冷却过程示意图 影响因素a）温度和时间）温度和时间 比比tmtm低低2525左右的温度是复性的最佳条件左右的温度是复性的最佳条件 越远离此温度，复性速度就越慢越远离此温度，复性速度就越慢 复性时温度下降必须复性时温度下降必须缓慢缓慢 降温时间太短及温差大不利于复性降温时间太短及温差大不利于复性 b）dna浓度浓度复性复性速度与速度与dnadna浓度的平方成正比浓度的平方成正比c）dna顺序的复杂性顺序的复杂性 顺序越简单，配对越快。顺序越简单，配对越快。dna片段愈大，扩散速度愈低，复性越慢。片段愈大，扩散速度愈低，复性越慢。 盐浓度越高，复性速度越快。盐浓度越高，复性速度越快。 d）dna分子的大小分子的大小e）溶液的离子强度）溶液的离子强度三）核酸分子杂交三）核酸分子杂交 分子杂交分子杂交(hy