第1章脑科学研究的方法

1、多学科综合多学科综合神经科学神经解剖学神经生理学神经生物化学心理学.第一章 脑科学研究的方法和手段多层次的研究认知神经科学计算神经科学临床神经科学系统和行为神经科学发生神经科学细胞神经科学分子神经科学神经科学研究水平研究水平l整体行为水平：整体行为水平：行为学，躯体感觉，视听行为学，躯体感觉，视听觉，痛觉等觉，痛觉等l细胞水平：细胞水平：神经细胞培养、生物电活动检测、神经细胞培养、生物电活动检测、通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测通路示踪、细胞染色、免疫化学、凋亡检测l分子水平的实验：分子水平的实验：离子通道、受体、酶、离子通道、受体、酶、遗传物质等遗传物质等一、形态学方法一、形态学方法二

2、、生理学方法二、生理学方法三、电生理学方法三、电生理学方法 四、生物化学方法四、生物化学方法 五、分子生物学方法五、分子生物学方法 六、脑成像（六、脑成像（Brain imaging）技术）技术 一、形态学方法常规染色和特殊染色常规染色和特殊染色束（通）路追踪法束（通）路追踪法 荧光组织化学法荧光组织化学法原位杂交法原位杂交法 受体定位法受体定位法神经系功能活动形态定位法神经系功能活动形态定位法 1.常用普通染色方法常用普通染色方法TTC染色染色 HE锇酸染色锇酸染色氯化金浸染氯化金浸染 Cajal银浸染色银浸染色 尼氏染色尼氏染色 HE（苏木素伊红）（苏木素伊红）锇酸染色是神经科学研究的一种

3、常用而普遍的方法，它本来是用来固定脂质的，由于髓鞘的主要成分是脂质，所以用于有髓神经纤维的染色 锇酸染色锇酸染色氯化金浸染氯化金浸染运动终板运动终板Ach荧光染色荧光染色氯化金浸染氯化金浸染Cajal银浸染色银浸染色尼氏染色尼氏染色l多种方法，HE、甲苯胺蓝，焦油紫，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及棓花青等碱性苯胺染料均可以使尼氏体着色 2、束（通）路追踪法：研究神经元之间的联系 束路追踪束路追踪l原理：轴浆运输原理：轴浆运输l示踪物质：示踪物质：HRP，荧光染料，荧光染料，各种标记物标记的葡萄糖，放射各种标记物标记的葡萄糖，放射性核素标记的氨基酸等。性核素标记的氨基酸等。l观察：观察：根据示踪

4、物质不同，采用根据示踪物质不同，采用组织显色、荧光显微镜或放射自组织显色、荧光显微镜或放射自显影等方法显影等方法。l轴浆运输法轴浆运输法利用神经元轴浆运输现象的追踪法利用神经元轴浆运输现象的追踪法. 追踪剂：辣根过氧化物酶追踪剂：辣根过氧化物酶(horseradish peroxoidase, HRP)、荧光染料包括核黄、荧光染料包括核黄(nuclear yellow)、固蓝、固蓝(fast blue)及荧光金及荧光金(fluorogold)、植物凝集素如麦芽、植物凝集素如麦芽凝集素凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)和菜豆凝集素和菜豆凝集素(phaseolus vu

5、lgaris agglutinin)、细菌毒素如霍乱、细菌毒素如霍乱毒素、病毒如活的神经病毒毒素、病毒如活的神经病毒 (胞疹病毒和弹状病毒）胞疹病毒和弹状病毒） l 变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离变性法：利用神经元包体受损或神经轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反断后远侧轴突的变性，或轴突切断后细胞的反应，来研究纤维的联系。应，来研究纤维的联系。 *物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、物理性方法：刀的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等。超声破坏等。 *化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅化学性破坏：兴奋性氨基酸（海人酸和鹅高蕈氨酸）、单胺类神经毒（羟多巴胺、高蕈氨酸）、单胺类

6、神经毒（羟多巴胺、羟多巴、双羟色胺）羟多巴、双羟色胺） l神经元质膜荧光染料法：神经元质膜荧光染料法： 用羰花青（用羰花青（carbocynine）荧光染料，可）荧光染料，可以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定以染出神经细胞的质膜，并可以在活体或固定的标本上追踪纤维联系。的标本上追踪纤维联系。 最新研究进展：最新研究进展：华人学者绘制小鼠大脑神经网络图华人学者绘制小鼠大脑神经网络图l不同的大脑区域必须相互沟通才能控制复杂的思想和行为，但目前对于这些区域组织成为广阔神经元网络的机制却相对知之甚少。2014年2月27日细胞（Cell）杂志上的一项新研究中，南加州大学董宏伟等研究人员采用神经元示

7、踪技术绘制出了一张小鼠全脑图谱，揭示了大脑皮质中数百条神经元通路。在显微镜下将可见的荧光分子注入到整个小鼠大脑皮质的不同区域，这些小分子沿着“细胞高速公路”运输，标记了大约600个神经元通路。研究人员采用高分辨率显微镜扫描了这些大脑区域，构建出了皮质连接的图像数据库。l当研究人员分析这些连接时，他们发现大脑皮质是一个高度组织化的网络，由八个子网络构成，它们协调活动反映动物的情感和感觉。并且，子网络之间以一种非常特殊的方式来共享这一信息。“这些研究发现挑战了流行假说：大脑皮质是一个单一的网络，在这一网络中所有一切都密集连接在一起。”l接下来，研究人员可将来自这一重要哺乳动物模型系统的解剖数据与大

8、量现有的分子遗传数据合并来鉴别神经细胞基本类型。“确定全脑的结构组织将是朝着揭示脑功能以及在神经系统疾病中功能障碍的结构基础迈出的基本且令人兴奋的一步，”董宏伟说。我们真的会永远不老吗？我们真的会永远不老吗？从从“科科学狂人学狂人”的抗衰老研究说起的抗衰老研究说起lJohn Craig Venter的身上从不缺乏话题。从单枪匹马与人类基因组计划展开竞争、时代杂志将他与人类基因组计划代表Francis Collins同时选为封面人物，到宣布制造出首个能够自我复制的活细胞“Synthia”，轰动了整个学术界，Venter的每一个举动，在学术界都会引起波澜。前阵子，他又宣称将组建新公司HLI，组建史

9、上最大的基因组数据库，结合基因组学、生物信息学及干细胞疗法，致力于抗衰老研究，并延长人类寿命。l【为什么我们会追求不老和长寿为什么我们会追求不老和长寿】l对于不老和长寿的探索，恐怕是除了“我们是谁”“我们从哪儿来”之外，人们思考的第三个问题了“我们能否一直存在下去”。l【对衰老和长寿的基因研究对衰老和长寿的基因研究】l有一个规律，很多问题，如果解释不了，就说它是由于基因决定的，多半错不到哪里去。也因此，生物学家、医学家们纷纷开始将遗传学和分子生物学结合，从基因的角度开始对长寿和衰老问题的探索。l目前基因方面的研究主要有两个方向，长寿基因和衰老基因。这里说的并不是单一的基因，而是与长寿和衰老有关

10、的多种基因，它们之间的相互作用带来了不老和长寿的结果。衰老的表现为染色体端粒长度的改变、DNA损伤、甲基化等，衰老的终点就是死亡，这些因素也是影响长寿的原因。l有科学家认为，端粒（细胞核两端的特殊DNA片段）长度决定生物的寿命，端粒的缩短会导致细胞分裂的停止和死亡的来临。发现端粒的三位科学家获得了2009年诺贝尔生理学或医学奖。l目前“长寿基因”和“衰老基因”还不能完全确定，但有学者认为，消除自由基的某些酶类基因、与细胞生长调控有关的某些基因与长寿和衰老相关。对于长寿和衰老基因，科学上还需要继续发现更多的相关基因，理清那些导致衰老、影响长寿的基因群及其之间的联系，才能在理解基因组的基础上，解决

11、衰老、长寿的问题。l【其他长寿和抗衰老的办法其他长寿和抗衰老的办法】l除了基因研究外，还有抗衰老制剂的研究。褪黑素与微量元素是被认为有抗衰老作用的物质。褪黑素的自由基清除能力在众多自由基清除剂中表现特别突出，而微量元素摄入不协调，将导致衰老。l还有一种说法，节食能够延长寿命。这背后的生物学原理是：生长激素和胰岛素信号途径在起作用。科学家通过对猴子、酵母菌、果蝇等动物的研究中验证了减少卡路里摄入能够延长寿命的理论。l另一些科学家提出引起机体衰老和疾病的是自由基的增多，这也是现实生活中那些宣称“清除自由基，恢复年轻态”的保健品所依赖的理论基础。这些保健品疗效有限，请不要轻易尝试。l除了遗传因素之外

12、，人生活的环境、人的心理状况等多方面因素都会影响到寿命。保持愉悦的心情，健康的生活方式，良好的饮食习惯，这样即使躯体不可避免的老化，但还是有年轻的心态，总好过长寿但不快乐，年轻的外表下，却住着一个老灵魂。l对于长寿基因及衰老基因的发掘，也有不赞同的声音。他们认为这违反了伦理道德，假使我们不老不死，那么进化的要领“生存和繁殖”，也会越来越少的被考虑，我们将剥夺后代的生存机会。l技术的进步带来的潜在社会问题，还有待进一步去解决。就目前的研究状况来看，长寿不意味着不会永生，科学的帮助下，人们有机会将有限的生命拉长，将有限的生命过得更有质量，实现不老不病的愿望。l此时又想到了Venter先生，据悉，V

13、enter曾作为美国海军医疗队的医院参加越战，战场的残酷使他认识到生命和时间的宝贵，他认为人生的每一分钟都应该有所创新。撇开进化的需要不谈，试想有一天，我们不再会变老，没有疾病，寿命很长，我们是否还会像出生即知将死的时候那样，珍惜生命中的每一天，而努力奋斗呢。3、荧光组织化学法 用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。用特异性抗体显示神经组织化学成分的方法。基本过程有：固定、制片、反应等三步。基本过程有：固定、制片、反应等三步。 l 免疫组织化学反应：有直接法和间免疫组织化学反应：有直接法和间接法接法 l 双重免疫组织化学染色：主要是双重免疫组织化学染色：主要是为了研究两种物质在同一细胞或突起

14、内为了研究两种物质在同一细胞或突起内的共存现象，或含两种不同化学物质的的共存现象，或含两种不同化学物质的相互关系。相互关系。免疫组化免疫组化l根据二抗标记的不同（荧光素、酶、铁蛋白、荧光素、酶、铁蛋白、胶体金或银标记），胶体金或银标记），免疫组化免疫组化包括免疫荧光、免疫酶组织化学、免疫金银及铁标记技术 l核酸分子杂交技术，检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。l基本原理是根据两条单链核苷酸互补碱基序列专一配对的特点，应用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（核酸探针（probeprobe），与组织切片或细胞内的待测核酸（RNA或DN

15、A片段）进行杂交，通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。4、原位杂交法 l此项技术需首先制备某种核酸探针，其种类主要有三种：利用大肝杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针(cDNA)；应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针(cDNA)；依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。lcRNA和cDNA的常用标记物有32S、32P、3H等放射性核素和荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质。l组织学应用的原位杂交术主要是染色体原位杂交染色体原位杂交和细细胞原位杂交胞原位杂交。前者是研究遗传基因、抗原基因、

16、受体基因、癌基因等在染色体上的定位与表达；后者是研究细胞某种蛋白质的基因转录物mRNA在胞质内的定位与表达。l核酸分子杂交术有很高的敏感性和特异性，它是免疫细胞化学的基础上，进一步从分子水平探讨细胞功能的表达及其调节机制的，已成为当前神经生物学研究的重要手段。5、受体定位法：研究受体在神经系统内的定位 配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位配体和受体结合以示踪其部位 免疫组织化学法：用针对受体的抗体免疫组织化学法：用针对受体的抗体6、神经系功能活动形态定位法 l脱氧葡萄糖法：脱氧葡萄糖法： 原理是：神经元活动时其能量代谢增加，

17、而其能量原理是：神经元活动时其能量代谢增加，而其能量代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖代谢主要依赖葡萄糖。在脑内存在脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)时，神经元可不加区别地将时，神经元可不加区别地将2DG与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是己糖激酶的与葡萄糖一起摄入细胞内，两者都是己糖激酶的底物。但底物。但2DG在其被磷酸化成在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被后，不能被磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖磷酸己糖异构酶进一步转化为果糖-6-PO4，不能继续，不能继续在糖酵解循环中代谢。如在在糖酵解循环中代谢。如在2DG上标以同位素。神经上标以同位素。神经元内同位素的堆

18、积程度反映了神经元的活动程度。元内同位素的堆积程度反映了神经元的活动程度。 lc-fos(Fos)法：法： c-fos是一种原癌基因，属于即刻早期基因类是一种原癌基因，属于即刻早期基因类(immediate-early gene).很多刺激条件可通过第二信很多刺激条件可通过第二信使引起神经元使引起神经元c-fos的表达增加，形成的表达增加，形成fos mRNA。由。由fos mRNA翻译成的翻译成的Fos蛋白，立即转位至细胞核内，蛋白，立即转位至细胞核内，与另一即刻早基因与另一即刻早基因c-jun 所产生的蛋白所产生的蛋白Jun构成二聚构成二聚体（第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列体（

19、第三信使），调节其靶基因的表达，引起一系列的细胞反应。的细胞反应。 l细胞色素氧化酶法：细胞色素氧化酶法： 神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供神经元线粒体内的细胞色素氧化酶是提供神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平神经元能量的重要酶，细胞色素氧化酶的水平与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺与神经元能量需求密切相关，一般反映慢性刺激的结果。激的结果。 二、生理学方法 l 损毁法损毁法l 刺激法刺激法l周身给药法周身给药法l脑室注射法脑室注射法l脑组织培养脑组织培养l亚细胞分析亚细胞分析l神经递质释放量的测定神经递质释放量的测定 l神经递质的功能测定神经递质的功能测定 l行为学方法行为学

20、方法 l最常用的有两种：神经行为学、电生理学最常用的有两种：神经行为学、电生理学1、神经递质释放量的测定（在体in vivo和离体in vitro)l推挽灌流法：推挽灌流法： 在体研究中枢核团递质释放的有用方法。在体研究中枢核团递质释放的有用方法。通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。从流出液中分析神经递质的变化。 l脑透析术脑透析术(brain dialysis)： 在特定的脑区内，植入透析探头，用生理在特定的脑区内，植入透析探头，用生理溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度溶液灌流时，细胞外液中的神经递质可顺浓度

21、递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌递度从透析管扩散至灌流液中，收集和测定灌流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变流液中神经递质的含量，就能监测该递质的变化过程。脑透析术的装置包括探头、导管、微化过程。脑透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定量分析仪。量灌流泵、样品收集器和定量分析仪。 抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经抗体微探针法：是在玻璃微电极上涂上一层神经肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放肽抗体，用于在中枢神经系统内定位神经肽的释放。硼硅玻璃与硼硅玻璃与r氨丙基三乙氧硅烷（氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri- etriethoxys

22、ilane）反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷反应后在玻璃表面形成一层带有游离氨基的硅氧烷(siloxane)多聚体微粒。多聚体微粒。该玻璃再用戊二醛该玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)处理，使戊二醛与蛋白质处理，使戊二醛与蛋白质A以共价键方以共价键方式偶联，蛋白质式偶联，蛋白质A再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针再与神经肽抗体结合，制成抗体微探针脑片灌流法突触体灌流法2、神经递质的功能测定 l 微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。近，观察其作用。l抗体微量注射：特异性的抗体注射在某些部位，抗体微量注射：特异性的抗体

23、注射在某些部位，可中和神经末梢释放出而进入突触间隙的神经可中和神经末梢释放出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，抗体微量注射肽，防止其与受体结合。因此，抗体微量注射所引起的功能变化可解释为消除该神经肽的生所引起的功能变化可解释为消除该神经肽的生理效应的结果。理效应的结果。l生物检测（生物检测（Bioassay）: 经典的方法经典的方法.如用水如用水蛭背最长肌测定蛭背最长肌测定ACh 的作用，灵敏度达的作用，灵敏度达10-10g.3、行为学方法 l 经典条件反射：代表了刺激与强化的关系。经典条件反射：代表了刺激与强化的关系。l操作式条件反射：是通过动物自身的某个特定操作式条件反射：是

24、通过动物自身的某个特定操作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活操作动作而获得食物或回避有害刺激的反应活动。动。 lBehavioral neuroscience is the study of the neural mechanisms mediating normal and abnormal behaviors. l自主活动自主活动l动物焦虑检测：实施焦虑因素，如饮食或饮水剥夺，检测反应，可以用于药物筛选。l性和生殖行为：进化，神经内分泌作用机制l学习记忆学习记忆l摄食行为l惊恐反射l社会行为 .自主活动箱实验自主活动箱实验l动物的自主活动标志着动物中枢神经系统的兴奋状态中枢神经系统的兴奋

25、状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，抑制时则自主活动减少。观察动物自主活动是评价中枢神经兴奋状态的一项主要指标。l多种作用于中枢神经系统的药物都可影响动物的自主活动，因而自主活动的记录是研究中枢神经系统药物的主要方法，而且在新药研究中，观察药物对动物自主活动的影响也是评价药物是否影响中枢神经系统的重要方法自主活动箱实验自主活动箱实验主要技术指标：运动次数运动次数洞板实验洞板实验检测小鼠自动活动，可用于新药，一般药理，神经系统的研究和中枢兴奋性，抑制性研究。主要技术指标：小鼠探小鼠探洞次数洞次数。学习记忆的行为学检测学习记忆的行为学检测 学习记忆功能包括空间学习记忆功能和非空间学学习记忆功

26、能包括空间学习记忆功能和非空间学习记忆功能。随着对大脑学习记忆机制研究的不习记忆功能。随着对大脑学习记忆机制研究的不断深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法的断深入以及寻找有效防治认知障碍类疾病方法的需要，使得动物行为学实验成为研究脑高级功能需要，使得动物行为学实验成为研究脑高级功能及其他神经科学的不可缺少的重要手段，客观准及其他神经科学的不可缺少的重要手段，客观准确地评价实验动物的学习记忆水平已成为神经生确地评价实验动物的学习记忆水平已成为神经生物学和神经药理学中非常重要的研究内容。物学和神经药理学中非常重要的研究内容。 学习记忆功能检测的常用实验程序学习记忆功能检测的常用实验程序空间学习记

27、忆任务空间学习记忆任务非空间学习记忆任务非空间学习记忆任务Morris水迷宫水迷宫T迷宫迷宫6或或8臂放射状水迷宫臂放射状水迷宫Lashley 迷宫迷宫放射状迷宫（放射状迷宫（8臂、臂、12臂）臂）H-W迷宫迷宫Y迷宫迷宫新奇物体认知新奇物体认知环形平台环形平台嗅觉辨别嗅觉辨别T迷宫迷宫穿梭箱实验穿梭箱实验跳台实验跳台实验 Morris迷宫迷宫 1981年，英国心理学家Morris首次设计应用了这种水迷宫及其程序。目的是帮助大脑学习记忆机制的研究。起初实验动物主要为大鼠，此后该迷宫系统成为评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的经典程序，广泛运用于神经生物学、药学等领域的基础和应用研究中。Morri

28、s水迷宫水迷宫 应用:判断动物空间学习记忆能力组成: 观察指标观察指标: :潜伏期，潜伏期，路径，不同象限的路径，不同象限的停留时间和长度，停留时间和长度，搜索策略等搜索策略等 Morris水迷宫水迷宫Morris水迷宫水迷宫l原理原理 水是啮齿类动物非常厌恶的刺激或环境。鼠在水池中水是啮齿类动物非常厌恶的刺激或环境。鼠在水池中就会急于寻找逃路。它们的习性为在水池四周寻找出就会急于寻找逃路。它们的习性为在水池四周寻找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻碍了这种企图。实口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻碍了这种企图。实验中设置的水下平台（用于小鼠的常为水面下验中设置的水下平台（用于小鼠的常为水面下1 c

29、m）可提供鼠栖身的场所。但在巨大的水面上，强迫游泳可提供鼠栖身的场所。但在巨大的水面上，强迫游泳的动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而避免的动物不能看见平台。它们若要快速找到平台而避免淹没就必须利用环境中的线索进行定位。从而检测了淹没就必须利用环境中的线索进行定位。从而检测了鼠记住环境中的线索及其与平台位置关系而对平台进鼠记住环境中的线索及其与平台位置关系而对平台进行定位的能力（学习记忆能力）。行定位的能力（学习记忆能力）。Morris水迷宫的优点水迷宫的优点l由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，由于对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，Morris水迷宫是判水迷宫是判断老年小鼠

30、空间学习记忆能力的特别有用的工具。断老年小鼠空间学习记忆能力的特别有用的工具。l驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剥夺。因此，避免了驱动动物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剥夺。因此，避免了剥夺食物和水后给实验动物带来的新陈代谢方面的问题。剥夺食物和水后给实验动物带来的新陈代谢方面的问题。l动物不必接受电休克，这在那些食欲促进任务（动物不必接受电休克，这在那些食欲促进任务（appetitive tasks）如辐射状迷宫和如辐射状迷宫和T迷宫中是常规的要求。迷宫中是常规的要求。l能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间

31、认知加工的过程，客观地反映其认知水平。程，客观地反映其认知水平。l将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰。对学习记忆过程检测的干扰。l既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测既可以检测空间参考记忆又可以检测空间工作记忆。在用固定平台测试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们试小鼠的空间参考记忆后再将平台的位置改为不固定，就可检测它们的工作记忆能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需的工作记忆能力。显然，寻找不固定平台的认知过程要复杂一些，需

32、要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。要动物对时间和空间上的分离信息加以整合和判断。l操作简便，数据误差较小。操作简便，数据误差较小。Morris水迷宫的不足之处水迷宫的不足之处l由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好的实验室可以实施。由于需要监视系统及分析软件，只有少数装备较好的实验室可以实施。l实验程序的设计需要考虑的因素较多，同时需要实验者具备一定的神经生理实验程序的设计需要考虑的因素较多，同时需要实验者具备一定的神经生理学、认知生理学和数理统计方面的知识，给实验的开展和结果的解释带来困学、认知生理学和数理统计方面的知识，给实验的开展和结果的解释带来困难，同时也限制了该迷宫

33、的深入广泛的应用。难，同时也限制了该迷宫的深入广泛的应用。l由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。由于体力消耗太大，体温也丧失过多，年老体弱鼠完成任务较困难。l并非所有鼠株都适合于并非所有鼠株都适合于Morris迷宫测试，如迷宫测试，如BALB/c不能学会该任务（成绩并不能学会该任务（成绩并不随天数的增加而进步），不随天数的增加而进步），129/SvJ的学习成绩也偏差。的学习成绩也偏差。l个体间的成绩差异巨大。个体间的成绩差异巨大。l某些株，如某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年龄相关性视路病变株的小鼠由于有年龄相关性视路病变(visual pathology)，在衰

34、老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在，在衰老时完成以视觉为基础的学习记忆任务时就会出现困难。在C57BL/6株，由于严重的秃头症（株，由于严重的秃头症（alopecia）存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上）存在，可能使某些小鼠产生抑郁，加上溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩。溃疡性皮炎，最终可能影响小鼠的游泳能力而影响实验成绩。l对轻微的学习记忆能力的减退，该迷宫程序可能不敏感。对轻微的学习记忆能力的减退，该迷宫程序可能不敏感。l所占实验场地过大。所占实验场地过大。 Lashley III水迷宫水迷宫Lashley III水迷宫水迷宫 是一种相对复杂的迷宫。它

35、含有动物必须学会避是一种相对复杂的迷宫。它含有动物必须学会避免的盲端（免的盲端（culs-de-sac）和动物必须做出正确的左）和动物必须做出正确的左或右拐弯的或右拐弯的T选择。实验进行选择。实验进行5天，每天进行天，每天进行2次测试次测试（上下午各（上下午各1次）。每天的次）。每天的2次测试被平均。指标包次测试被平均。指标包括：学习指数（正确进入数括：学习指数（正确进入数/进入总数）、游向目标进入总数）、游向目标时的盲端进入数及时的盲端进入数及T选择错误数、向后进入总数、逃选择错误数、向后进入总数、逃生所用时间等。生所用时间等。 八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫，是八臂放射状

36、旱迷宫，是OltenOlten和和SamnelsonSamnelson在在19761976年设计的，做为一年设计的，做为一种评估大鼠空间学习记忆的方法。种评估大鼠空间学习记忆的方法。它可以同时评估实验动物的工作记它可以同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆。忆和参考记忆。原理原理 利用利用食物食物作为激励措施而到达目的作为激励措施而到达目的地，饥饿的动物需要实行特别的搜地，饥饿的动物需要实行特别的搜索顺序或利用最短的时间或最小的索顺序或利用最短的时间或最小的错误来寻求奖赏。错误来寻求奖赏。 八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l装装 置置 八臂放射状旱迷宫是由从中央平台伸出的八臂放射状旱迷宫是由从中

37、央平台伸出的8个相等的臂个相等的臂呈放射状排列组成，呈放射状排列组成，8臂中有臂中有4臂的臂的末端放有食物末端放有食物，在同一，在同一天的整个实验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但天的整个实验过程中哪些臂中含有食物保持固定不变，但每天之间均有改变。迷宫周围有若干空间线索。实验前大每天之间均有改变。迷宫周围有若干空间线索。实验前大鼠需鼠需被剥夺食物和水被剥夺食物和水，实验开始时，大鼠被放在中央平台，实验开始时，大鼠被放在中央平台处后去寻找食物。在实验中大鼠需记住哪些臂已被探索过处后去寻找食物。在实验中大鼠需记住哪些臂已被探索过，食物已被摄取，以避免再次进入，从而在最短的时间内，食物已被摄取，

38、以避免再次进入，从而在最短的时间内获得最大量的食物。同时，在每天的实验结束后，大鼠还获得最大量的食物。同时，在每天的实验结束后，大鼠还必须放弃当天的记忆信息，以准备适应第二天的实验。必须放弃当天的记忆信息，以准备适应第二天的实验。 八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l应用应用 评估动物工作记忆工作记忆和参考记忆参考记忆 工作记忆工作记忆是指利用一个仅仅在短时间内的保留信息，或称为实验特定信息（trial-specific information）而获得的记忆，它是对实验中可变事物的记忆能力。 参考记忆参考记忆是对持续存在的信息，或称为任务特定信息（task-specific informatio

39、n）的记忆，它是对实验中不变事物的记忆能力。八臂放射状旱迷宫八臂放射状旱迷宫l观察指标观察指标时间测定和错误积分l存在的问题存在的问题l优点：同时评估实验动物的工作记忆和参考记忆l不足：l气味的影响。包括食物的气味、其他动物的气味以及动物自身的气味。l实验动物被限制食物和水，由此会带来的影响。l并且不同的食物奖赏也可产生明显的影响；l另外，动物种属的不同使其在食物需求上也可导致不同的结论。穿梭箱实验穿梭箱实验l试验装置实验箱大小为50cm16cm18cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒，箱底中央部有一高1.2cm的挡板，将箱底部分隔成左右两列。实验箱顶部有光源，蜂鸣音控制器。l训练时，将大白鼠

40、放入箱内任何一侧，20s后开始呈现灯光和（或）蜂鸣音，持续15s，后10s内同时给以电刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，动物只对电击有反应，即逃至对侧以回避电击。20s后再次出现条件刺激并继之在动物所在侧施以电刺激，迫使动物跳至另一侧如此来往穿梭。当蜂鸣音或灯光信号呈现时，大白鼠立即逃至对侧安全区以躲避电击，即认为出现了条件反应(或称主动回避反应)。每闲天训练一回，每回100次。约训练45回后动物的主动回避反应率可达8090。l此法可同时观察被动和主动回避性反应.此外 从动物的反应次数也可以了解动物系处于兴 奋或抑制状态。穿梭箱实验穿梭箱实验l自动记录系统可以输出以下内容：(

41、1)动物序号；(2)遭受刺激次数；(3) 遭受刺激时间；(4) 主动回避反应时间。l 以上各值均为在设定的穿梭次数内反应的总和。遭受电激次数是被动回避的次数，该值与设定循环次数之差即为主动回避次数；刺激时间是指动物在被动回避过程被动回避过程受到电刺激的时间和，该值愈小，说明动物被动反应愈敏捷，主动回避时间主动回避时间是指动物在接受条件刺激的时间长短，该值越短，说明动物主动回避反应越迅速跳台试验跳台试验 跳台实验属一次性刺激回避反应实验（ONE TRAIL AVOIDANCE TEST）。 装置：试验装置为一长方形反射箱，大小为10cm10cm60cm，用黑色塑板分割成5间。地面铺以栅栏，间距0

42、.5cm，可以通电，每间角落置一高和直径均为4.5cm的平台。跳台试验跳台试验l原理原理 在一个开阔的空间，动物大部分时间都在边缘及角落里活动。在一个方形中心设置一个高的平台，当把动物放在平台时，它几乎立即跳下平台并向四周探索接近边缘l指标指标 潜伏期：记录动物从上平台到第一次下平台的时间l操作步骤操作步骤 一个典型的例子包含三个过程：熟悉过程熟悉过程 学习过程学习过程 记忆检测记忆检测l熟悉过程：将动物放在平台上，开始计时，至动物跳下。此时间段为潜伏期。动物探索10s以后，放回笼中l学习过程：动物一旦从平台上跳下后，立即受到电刺激，然后放回笼中l记忆检测：学习试验24h后，将实验动物重新放回

43、平台上，记录跳下平台的潜伏期。动物跳下平台或持续停留在平台上标志着验的结束（终止时间为60s）。l将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至栅栏上，受到电击后又迅速跳回平台。如此训练5min，并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数（number of errors），以此作为学习成绩。24h后重做测试，此即叫记忆保持测试。记录受电击死亡动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误次数。三、电生理学方法 电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电生理学的方法包括胞外记录、胞内记录、脑内电刺激、电

44、压钳、膜片钳、脑电图等技术。电刺激、电压钳、膜片钳、脑电图等技术。 1、电生理常用仪器、电生理常用仪器l 阴极射线示波器阴极射线示波器:高灵敏度，扫描速度慢高灵敏度，扫描速度慢l 生物电放大器生物电放大器l 电子刺激器电子刺激器l 贮存和分析电生理实验结果的仪器：贮存和分析电生理实验结果的仪器： 如示波如示波器照相机和计算机。器照相机和计算机。2、电生理学的常用方法、电生理学的常用方法l 细胞外记录细胞外记录(Extracellular recording)：把引导电极：把引导电极安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。安放在神经组织的表面或附近引导神经组织的电活动。l胞内记录胞内记录

45、(Intracellular recording)：研究神经元基本：研究神经元基本生物物理特性的有力手段。生物物理特性的有力手段。EPSP,IPSP,AP(动作电位动作电位)l脑内电刺激：是研究中枢功能定位的方法之一。脑内电刺激：是研究中枢功能定位的方法之一。 l顺行冲动记录法顺行冲动记录法(Orthodromic impulse recording)：就是电刺激某一突触前的细胞体、：就是电刺激某一突触前的细胞体、树突或轴突，在此突触后神经元细胞体上记录树突或轴突，在此突触后神经元细胞体上记录此刺激引起的电活动变化。此刺激引起的电活动变化。l逆行冲动记录法逆行冲动记录法(Antidromic

46、impulse recording)：逆行冲动记录法即电刺激神经元：逆行冲动记录法即电刺激神经元的轴突主干或末梢，在同一神经元胞体记录反的轴突主干或末梢，在同一神经元胞体记录反相传导的动作电位。相传导的动作电位。 l电压钳技术电压钳技术(Voltage Clamp)： 通过插入细胞内的一根微电极向细胞内通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值的不变。经过离子通道的也能控制膜电位数值的不变。经过离子通道的离子流与经微电极施加的

47、电流方向相反，数量离子流与经微电极施加的电流方向相反，数量相等。相等。 SG:信号发生器，信号发生器，FBA:反馈放大器，反馈放大器，V监监测膜电位测膜电位l膜膜(斑斑)片钳技术（片钳技术（Patch Clamp）：）： 可以从分子水平研究细胞膜离子通道的功能，是可以从分子水平研究细胞膜离子通道的功能，是用玻璃微电极吸管和只含个离子通道，面积为用玻璃微电极吸管和只含个离子通道，面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，此片膜内开放所产生电极尖端与细胞膜的高阻封接，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一极敏感

48、的电流监视器（斑的电流流进玻璃吸管，用一极敏感的电流监视器（斑片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。电流。膜片钳（膜片钳（patch clamp） 内尔内尔(Neher) 萨克曼萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、这一成果对于研究细胞

49、功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人二人共获共获19911991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。膜片钳膜片钳经典记录模式：经典记录模式： 贴附式（贴附式（Cell-attached Cell-attached 或或 on cell)on cell) 内膜向外式内膜向外式(Inside-out)(Inside-out) 外膜向外式外膜向外式(Outside-out)(Outside-out) 全细胞记录方式全细胞记录方式(Whole-cell recording)(Wh

50、ole-cell recording) l脑电波测定脑电波测定: 用双极或单极引导法，将引导电极放在用双极或单极引导法，将引导电极放在脑活动区颅骨表面之上，可以记录出能变换方脑活动区颅骨表面之上，可以记录出能变换方向的微弱电流。通过强力放大记录出来的电位向的微弱电流。通过强力放大记录出来的电位称脑电图（）。称脑电图（）。 l诱发电位诱发电位: 中枢神经的任何部位对于故意刺激感受器官，中枢神经的任何部位对于故意刺激感受器官，感受神经、感觉通路上的任何一点，或与感觉感受神经、感觉通路上的任何一点，或与感觉器官有关的任何结构上的一点，所产生的电变器官有关的任何结构上的一点，所产生的电变化，叫做诱发电

51、位（化，叫做诱发电位（evoked potential)。 l经典的生物化学方法包括：l离心离心l电泳电泳l层析层析l质谱质谱等l由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合，又发展了：l放射免疫放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)l放射受体放射受体l免疫印迹免疫印迹等方面四、生物化学方法 1、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜、用离心法分离制备突触小体及突出小体膜 突触小体突触小体: 是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末是指脑组织在等渗溶液中匀浆时，神经末梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢的细胞膜从轴突上自发断裂、封闭而形成的神经末梢单位。它包括突触前膜、

52、突触后膜及致密斑和包围梢单位。它包括突触前膜、突触后膜及致密斑和包围在突触前膜的突触小泡在突触前膜的突触小泡(vesicle内含神经递质内含神经递质)，线粒，线粒体及胞浆蛋白质。由于突触小体是神经介质及受体的体及胞浆蛋白质。由于突触小体是神经介质及受体的主要聚集部位，突触小体的制备便成了神经介质及受主要聚集部位，突触小体的制备便成了神经介质及受体的基本制备手段。体的基本制备手段。 离心（离心（centrifuge）l离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉

53、降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 离心离心l离心机种类制备型离心机 普通：（6000rpm以下） 高速冷冻（25000rpm以下） 超速（可达5000080000 rpm ）分析型离心机离心离心l制备型离心方法差速沉降离心法差速沉降离心法 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）密度梯度区带离心法（简称区带离心法） 2、层析法、层析法: 特点：分离生物活性物质时不使其失活，可特点：分离生物活性物质时不使其失活，可大量制备。大量制备。 基本原理：被分离物质与支持物相互作用的基本原理：被分离物质与支持物相互作用的紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度不同。紧密程度不同，流洗时被洗脱的难易程度不同。

54、常用层析方法常用层析方法l离子交换层析l凝胶过滤层析l亲和层析l疏水层析l高效液相离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析亲和层析亲和层析3、放射免疫、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)测定神测定神经介质：经介质： 利用抗体利用抗体(Ab)特异地识别其抗原（特异地识别其抗原（Ag）的）的原理，将抗原标记放射性同位素（原理，将抗原标记放射性同位素（*Ag），用），用来测定与来测定与*Ag抗原性相同的物质。抗原性相同的物质。 4、放射受体测定受体法：、放射受体测定受体法： 利用标记能作用于不同靶组织内各种受利用标记能作用于不同靶组织内各种受体的递质和激素，从而达到直接测定

55、配体与其体的递质和激素，从而达到直接测定配体与其受体形成络合物的过程和理化特性。受体形成络合物的过程和理化特性。5、免疫印迹法（、免疫印迹法（immunoblotting 或或western blotting）鉴定生物分子：鉴定生物分子： 是将电泳凝胶分离出来的电泳带移到特殊的滤是将电泳凝胶分离出来的电泳带移到特殊的滤膜上，再利用标记抗体与滤膜上某一蛋白质或肽的特膜上，再利用标记抗体与滤膜上某一蛋白质或肽的特异结合，使其显色。异结合，使其显色。 优点：一是将传统的电泳凝胶染色法的敏感度优点：一是将传统的电泳凝胶染色法的敏感度提高了提高了1001000倍，二是倍，二是RIA与相似，能从多种蛋白与

56、相似，能从多种蛋白质中选择鉴定出一种特异的蛋白质，其敏感性可达质中选择鉴定出一种特异的蛋白质，其敏感性可达1ng，同时又能知道这一蛋白质的分子量，这又是，同时又能知道这一蛋白质的分子量，这又是RIA无法达到的。无法达到的。6.电泳电泳l电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 l电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质带电性质以及分子本身大小大小、形状形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 l电泳技术有很多种方法，介绍最常用的两种：水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪蛋

57、白质蛋白质SDS-PAGE电泳电泳染色结果染色结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳天然琼脂（天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占，约占80%）及琼脂胶（）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用生较强的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖琼脂糖

58、为电泳支持物进行平为电泳支持物进行平板电泳。板电泳。 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸: 如重组质粒的鉴定，如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。酶谱制作等。琼脂糖浓度与琼脂糖浓度与DNA分离范围分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度 /%线状线状DNA大小大小/kb 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 30-1 12- 0.8 10-0.5 7-0.4 3-0.2 2-0.05凝胶的制备与电泳凝胶的制备与电泳样品配制与加样样品配制与加样染色和拍照染色和拍照五、 分子生物学方法 、神经生物学研究中常用的分子生物学方法、神经生物学研究中常用的分子生物学方法l基

59、因的分子克隆基因的分子克隆l克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的表达克隆后的基因在人工体外表达系统或细胞中的表达l克隆后的基因作为探针研究基因表达的组织特异性和克隆后的基因作为探针研究基因表达的组织特异性和发育阶段特异性发育阶段特异性l研究基因转录调控区的结构特征有助于理解基因转录研究基因转录调控区的结构特征有助于理解基因转录调控机制调控机制 2、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（PCR）：）： 在神经生物学研究中有广泛的用途，如可在神经生物学研究中有广泛的用途，如可应用它发现和分析新基因，测定应用它发现和分析新基因，测定mRNA 、反向遗传学利用制造体内基因突变的方法研、反向遗传学利用制造体内基因突变的方法研