胶体金的相关知识

1、免疫层析试纸包被技术简介试纸生产过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液（胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中満加杆-«»，-样品凉动方向 样品峑段测號T用桂鱗c狈水*M+展析膜"C硝酸幷犁未醍）PVCtt使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用 0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。 WhatmarSchleicher & Schuell的膜属于纯采用10

2、0%勺纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类 即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好 C/T线，然后用特定配方的溶液将膜 进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划 膜。在结合物溶

3、液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进 行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在 单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3-7mm,不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程 中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即 可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适 合规模生产。在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。而一般的浸泡或铺金工艺满足不了要求。这时可用气动喷头叠加喷

4、线成面。通 过对溶液量和气体压力的调节，往往可以取得好的效果。划膜笔定伸展长度和角度划线时完Air Sprayer划线/喷金/喷线/喷点技术划膜笔采用PEEK材质的 中空纤维管，属于接触式成 线方式。相比其问世前的不 锈钢针管和拉伸玻璃纤维 管而言，该纤维管具有优良 的韧性和恰到好处的柔软 度，划膜笔头与膜面接触的 端面经过特细砂纸打磨，以全不会损伤微孔膜结构。纤维管内孔直径为0.23mm，试剂溶液内的正常溶质不可能堵塞该纤维管，同时液体流出时没有积累压力，管道内的溶液随高精度泵的推动即时流出，使 高精度泵的恒稳液流得到完美表现。该划膜笔的PEEK管材在刚面世的2000年即被Biodot 公司

5、选用为Frontline，延用至今，可见其性能的完美。但膜面划线效果并不唯一取决于泵和划膜笔头。溶液均匀匀速地划于膜面后，如膜的亲水性不均匀，溶液润湿扩散效果不好，形成的线条也就不会整齐均匀。在某些不选用硝酸 纤维素类膜而选用其他材质（如特细玻璃纤维，其表面不够平滑细腻）的试纸产品中，划 膜笔的溶液无法均匀稳定的传递到膜材的各个纤维，其成线完全靠溶液在纤维间的被动扩 散，效果也就不如人意了。气动喷头层析试纸中的结合物（胶体金）材质一般采用玻璃纤 维、聚酯纤维、特种层析纸或无 纺布。鉴于这些材质的纤维网间 隙大，纤维分布不够均匀，因此 将结合物（胶体金）溶液通过恒 定压力的气体雾化后喷射在膜材

6、的纤维网内，使溶液一次性主动 扩散在特定的面积范围内，其效 果远优于将溶液直接喷射或划膜 笔头划在该类材质表面。鉴于溶液通过高精度泵 恒定推进，气体压力恒稳控制，因此其喷射的溶 液线很均匀，溶液量可控制调节，效果也容易重 复。在一般的夹心法试纸中，结合物（胶体金） 经常通过将整条或整片膜材放入溶液中浸泡或通过特定的工艺进行溶液平铺， 然后将膜材干燥。当有溶液在膜材上流动时，干燥后的膜材平面上结合物（胶体金）往往分布不均匀。而在竞争法的 产品中，试纸条上结合物的量直接关系 到cutoff值，因此竞争法产品更需要用 气动喷头进行结合物（胶体金）的均匀 喷线。气动喷头主要部件为中心的溶 液不锈钢管与

7、压缩气管。溶液通过高精 度步进泵从不锈钢管中均匀稳定地流 出，迅即被四周的恒压流动气体雾化， 直接喷射出喷孔，气体和液体完全同步 流动，不会有任何脱尾或大点现象。气 动喷头体积小巧精致，直径约8mm可以 将多个喷头并排进行喷金，大大提高工 作效率。电磁阀喷射头在高精度泵的配合下，喷射头通过对特种电磁阀的开闭控制调节塑料 管内溶液压力，在特定压力下开阀，液体即喷射成线或成滴。层析试纸生产溶 液喷射成线，与划膜笔头成线的差异不在于液体的量有差异，而在于溶液在膜 空隙中扩散的速度有差异，前者主动扩散，后者被动扩散。当层析膜材质性能稳定时，这方面并不导致免疫反应信号的差异。Biodot将电磁阀的高频震

8、荡开关与高精度步进泵的同步程序控制形 成的喷射技术申请了专利。但该技术的致命缺陷是电磁阀及喷嘴经常出现不可 预见的堵塞或散射现象。同时其垄断性的电磁阀成本一直居高不下。目前有客 户开始直接将电磁阀拆下，直接接上划膜笔，可得到稳定的划线效果。金标公 司提供成套的划膜笔及支架进行由喷线至划线的改造。划膜/喷线/喷点/喷金仪器简介金标公司提供三种溶液包被平台：平台移动式、 带连续式、划膜笔移动式。移动式平台平台移动式共有三种产品，即HM3O10HM3O30 HM3230是目前市场上使用量最大的品种。 平台式仪器能适应多种试纸 包被工艺，如划膜工艺（直接在 NC膜上划线），划板工艺（在贴膜的底板上划

9、线），喷金工艺，封闭工艺（对样品垫及膜均匀喷涂）等。新建立免疫层析试纸 条研发生产平台的客户，如果没有以往的成熟经验确认后续规模生产只需要特定单一的工艺流程，建议最好采购这类平台式仪器，以适应后续生产研发中不同产 品不同工艺的需要。该系列仪器可配制多达六个单联泵，或多个8联泵。具体请 咨询。输送带式平台输送带式平台目前品种为HM8000主要 适合划板操作，即先贴膜后划线的工艺。它能极 大的提高生产效率，单人操作时正常可达到 800-1000大板/小时（按膜长度约300米/小时）的速度。出于省人工，提高效率的目的，欧美厂家较偏爱卷式划膜仪器，卷式仪器的速度一般也就300米/小时，而划膜后往往还是

10、由手工进行贴膜。而达到同 样速度的HM8000则要求先贴膜，后划板。此外卷式划膜仪器的购置费用很大，维护费用也偏高。同时这种仪器生产时需要上卷卸卷，划膜完收卷前需要临时的 干燥处理，收卷后还需要进一步干燥。收卷后干燥一般要求用真空工艺， 如果用 一般的烘干工艺，则需要将卷膜人工松散开来，费工费力。相比较 HM800Q更 加没有优势。划膜喷金模块金标公司特殊设计了划膜/喷金/喷线模块。当平台同时 配置划膜喷金头时，该模块可同时安装四根划膜笔头， 一个气动喷头。划膜笔头和气动喷头的高度可独立调整， 避免在喷金模式时划线笔头的高度不够而与平台面的工 件如磁压条等发生碰撞，或在划线模式时喷金头与平台

11、上工件碰撞。四个划线笔头的间隔距离可通过外插的钥匙头带动微型丝杆进行无级调节。划线笔头的旋转角度可适当调节。此外根据需要可调节不锈钢夹头间隙，划线笔在孔隙中能自由抽动，以调整划线笔头的探伸长度，确保笔头对硝酸纤维素膜的适当压力，保证层析膜表面溶液成线的效果。该模块可用来将Biodot的电磁阀喷射头改造为划膜笔。金标公司开发了多种机型的切刀。所有切刀的刀具都采用特种耐磨的合金钢材料， 采用面磨剪切方式，刀片间隙可调。机器的送料系统经过特殊改进设计，改用了特 殊耐磨的特种塑胶材料和送料传动电机，能保证良好的斩切精度。大部分机械部件 采用数控机床加工，保证了质量和装配精度。公司购买了高精度数控磨床，

12、长期提 供刀具平面修磨服务。产品名称产品代号工作速 度板宽mni残留mm吹风挡料器工作效率微电脑自动斩切 机ZQ20002009813选配无9500条/小时微电脑快速斩切 机ZQ240024012813选配选配11400条/小时数控咼速斩切机ZQ40004509813选配选配21000条/小时数控快速斩切机ZQ500040012813选配选配19000条/小时数控感应斩切机ZQ42004509820选配无21000条/小时免疫胶体金技术(Immune colloidal gold tech nique)作者：发布日期：(2009-05-10)浏览次数：0次胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的

13、优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。 在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生 物芯片中都可能例用到。1971年Faulk和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫 学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析 法(immu no chromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法 (Dot-immuogold filtratio n assay DIGFA)用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。(一) 基本原理免疫胶体金技术是以胶体金作

14、为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCb）在还原剂如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶 体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是 静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA PHA ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫 和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。（

15、二）胶体金的制备胶体金的制备一般采用还原法，根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制 备胶体金颗粒的方法如下：1枸橼酸三钠还原法（1） 10nm胶体金粒的制备：取 0.01 % HAuCb水溶液100ml，加入1 %枸橼酸三钠水溶液 3ml, 加热煮沸30min，冷却至4C,溶液呈红色。（2） 15nm胶体金颗粒的制备：取0.01 % HAuCb水溶液100ml，加入1 %枸橼酸三钠水溶液 2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K 2CG0.5ml，混匀即可。（3） 15nm 18nm20nm 30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取 0.

16、01 % HAuCb水溶液100ml，加热煮沸。 根据需要迅速加入 1%枸橼酸三钠水溶液 4ml、2.5ml 、1ml 或 0.75ml ，继续煮沸约 5min， 岀现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nmo金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改 变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见表表1 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1%柠檬酸三钠 ml0.300.450.701.001.502.00金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红1红橙红橙吸收峰（nm）2202405355

17、25522518径粒（nm）14797.571.54124.5152. 鞣酸-枸橼酸钠还原法用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶A液：1% HAuCh水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。B液：1 %枸橼酸三钠 4ml, 1 %鞣酸0.7ml , 0.1Mol/L K?CG液0.2ml ,混合，加入双馏水至 20ml将A液、B液分别加热至60 C,在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm如需要制备其它直径的金颗粒，则按表2所列的数字调整鞣酸及冷CO的用量。表2鞣酸-枸橼酸钠还原法试剂配制表金粒直径A液B液(nm)1 %HAuC4

18、双馏水1 %枸橼酸三钠0.1MOI/L K 2CQ1%鞣酸双馏水517940.200.7015.101017940.0250.1015.8751517940.00250.0115.98753白磷还原法在120ml双蒸馏水中加入 1.5ml 1%氯金酸和 1.4ml O.1mol/L K2CO3 ，然后加入 1ml五分之一 饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置 15 分钟，在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。此法 制得的胶体金直径约 6nm,并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采 用。要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系

19、数（CV）可小于15%。4制备高质量胶体金的注意事项（ 1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定 的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳 定性，不能获得预期大小的金颗粒。（ 2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45卩m过滤，以除去其中的聚合物和其它可能 混入的杂质。（3）配制胶体金溶液的 pH以中性（pH7.2 ）较好。4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。(5)氯金酸配成1%水溶液在4 C可保持数月稳定，由于

20、氯金酸易潮解，因此在配制时，最好 将整个小包装一次性溶解。(三) 免疫胶体金的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。1 待标记蛋白溶液的制备由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强 度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心 除去。将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCI 溶液中4 C透析过夜

21、，以除去多余的盐离子，然后100 000g4 C离心1h，去除聚合物。2 待标胶体金溶液的准备以O.IMoI/L K2CO3或0.1MoI/L HCI调胶体金液的 pH值。标记IgG时，调至9.0 ;标记McAb 时，调至8.2 ;标记亲和层析抗体时，调至 7.6 ;标记SPA时，调至5.96.2 ;标记ConA时， 调至8.0 ;标记亲和素时，调至910 (表2)。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。表3 常用几种蛋白质标记时胶体金的PH蛋白质PH抗体8.0-9.0SPA6.0过氧化物酶8.0低密度脂蛋白5.5ConA8.0亲和素9.0-10.0

22、3 胶体金与标记蛋白用量之比的确定(1) 根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。(2) 将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0 硼酸盐缓冲液做系列稀释为5卩g/ml50卩g/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10 % NaCI溶液，混匀后静置 2h,观察结果。（ 4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出 由红变蓝的聚沉现象； 而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定 1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白

23、质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适 当增加10%20%。4胶体金与蛋白质（ IgG ）的结合将胶体金和IgG溶液分别以O.IMoI/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体 金溶液，继续搅拌 10min ，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用 稳定剂是5 %胎牛血清（BSA和1 %聚乙二醇（分子量 20KD）。加入的量：5 % BSA使溶液终浓 度为 1%；1%聚乙二醇加至总溶液的110。5胶体金标记蛋白的纯化（ 1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速 度和离心时间。用BSA做稳定剂的胶体金

24、一羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min , 5nm金胶粒用1 800r/min ） 20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用 6 000g，4C离心1h ； 20nm40nm胶体金结合物，14 000g，4 C离心1h。仔细吸岀上清，沉淀物用含1 % BSA的PB液（含0.02 % NaN3，将沉淀重悬为原体积的1/10，4 C保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18 C保存一年以上。为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心 , 分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。（2）凝胶过滤

25、法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/51/10。再经 1 500r/min 离心 20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶 S-400 ）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm x20cm，加样量为床体积的 1 /10,以 0.02Mol/L PBS液洗脱（内含 0.1 % BSA, 0.05 % NaN3, pH8.2 者用 IgG 标记物），流速为 8mI/h 。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤岀的液体为微黄色， 有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随

26、浓度的增加而红 色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱岀略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合 物过滤除菌、分装,4 C保存。最终可得到70%80%的产量。6胶体金蛋白结合物的质量鉴定（ 1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥 后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100 个金颗粒的平均直径。（2） 胶体金溶液的 OD520nm直测定：胶体金颗粒在波长510nm550nm之间岀现最大吸收值峰。用 0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含 1% BSA, 0.02 % NaN3 将胶体金蛋白试剂作1 : 20 稀释，OD520=0.

27、25左右。一般应用液的OD520应为0.20.4。（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（Ml IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或 抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏 感性进行鉴定。7. 胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存 胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。 金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒 外面的水化膜

28、使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加 溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液 pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质 的等电点，女口 ConA，过氧化物酶等，当 pH较低时保持稳定，提高 pH则显得不稳定，接近等电 点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000作为稳定剂。在410 C贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。(四) 胶体金标记技术在免疫学中的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需

29、要使用放射性同位素，或 有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的 免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。1. 液相免疫测定将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直 接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法(Sol particle immunoassay ,SPIA)已成功地应用于 PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。2. 胶体金在电镜水平的应用胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应

30、用不 同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3 15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。 315nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。 金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标 记技术和原位杂交技术等。实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既 可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。3. 胶体金在光镜水平的应用胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均 可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切片中抗原的检测。 胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰 等缺点。4. 金标记流式细胞术应用荧光素标记的抗体，通过流