[基础医学]流式技术在白血病诊断的应用

1、免疫分型 白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一 国 际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。 流式细胞术：利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）探针， 多参数分析细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型。 了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 流式细胞仪诊断白血病的依据流式细胞仪诊断白血病的依据1、FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达2、至今尚未发现白血病的特异抗原。3、能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。（抗原的表达 与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。 白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但

2、仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因 而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。）即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型 的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、 表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。 流式细胞仪诊断白血病的意义流式细胞仪诊断白血病的意义1、FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的（国际白血病MIC分型协作组）1、用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。、形

3、态 学为急性淋巴细胞白血病（ALL）急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。、混合性白血病。、部分髓系 白血病。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。 2.临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。3.疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 4、与染色体检查共同对白血病进行诊断免疫分型常用的免疫标志及其意义免疫分型常用的免疫标志及其意义1 1白血病系列分化抗原白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病：CD3CD3、CD5CD5、CD7CD7。B淋巴细胞白血病：CD10CD10、CD19CD19、CD22

4、CD22。NK淋巴细胞白血病：CD16CD16、CD56CD56、CD57CD57。髓系白血病：CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33、MPOMPO（髓过氧化物酶）。红白血病：GlyAGlyA（血型糖蛋白A）。巨核细胞白血病：CD41CD41、CD42CD42、CD61CD61。白血病系列非特异性抗原白血病系列非特异性抗原CD34、HLADR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。 干/祖细胞CD34、HL ADR、CD38， 原始细胞CD34、HLADR、CD38， 幼稚细胞CD34、HLAD R、CD38（如早幼粒细胞）白血病分化阶段抗原白血病分化阶段抗

5、原T细胞抗原CD4、CD8B细胞抗原：CD10、Cy（胞浆链）、 SmIg（表面膜免疫球蛋白）、 CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、 CD11C 。白细胞共同抗原白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原，其表达量： 淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞， CD45不表达红细胞（中 ，晚幼红细胞，成熟红细胞）。 SSC/CD45 PerCP双参数分析鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。 FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。白血病及淋巴瘤免疫分型白血病及淋巴瘤免疫分型1AMLMO：1）有低的SSC和

6、FSC。在CD45SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD16，但 MPO比CD13与CD33更灵敏。2）一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。3）一般HLADR、CD34阳性，有些研究表 明CD7与CD34共表达在AML且预后差。M1：1）CD13、CD33、HLADR， (CD34M1， CD34CD33 2）多数病例HLADR（-）。3）CD45SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45SSC图有 助于确定blasts比例。M3、高颗粒性，具较高的SSC， CD45成熟C， CD34M5FSS和SSC，CD4 5SSC M4与

7、M5M0、M1，CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33 CD13，CD33（）(重要的表型)M5: CD13（）、CD34（）， CD56（）(部分)。 M6： HLADR，CD34、CD13、CD33阳性， CD45SSC图显示主要为红系成份。M7：1） CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）阳性。2）Gpb/a与CD34以减少激活血小板的粘附。 M62ALL：ALL：儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25 在成人，ALL约占急性白血病的25。ALL分为： B祖细胞型， CD10或CD10， 前B细胞型， B细胞型， T细胞型。B祖细胞型ALL：在幼儿约占A

8、LL的6570，青少年为5560，成人为50。在儿童： CD10（约90），在幼儿：CD10（ CLL。CLL：CD5、 FMC7、CD22与SIg，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为PLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12） 因为它们危险性更大。 流式细胞仪免疫分型实验流式细胞仪免疫分型实验1 1样本采集、运输、保存和操作样本采集、运输、保存和操作样本类型：外周血、 骨髓穿刺液、 骨髓活检物、 淋巴样组织活检物、浆液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检 物）、细针穿刺物等等。抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA或肝素抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他体液用EDTA、或肝素均可，（ED

9、TA的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快）；样本的保存：样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度息息相关。理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。短期保存（1小时或更短）应在室温(18-22); 长时间保存血或骨髓标本室温即可，部分4为佳。标本保存的时间上限取决于标本类型及其保存条件：肝素（血和骨髓）48-72小时；EDTA（血和骨髓）1224小时。对于只做胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。（固定方法取决于要分析的抗原特性和染色方式，采用之 前一定要进行新鲜标本的对照和验证实验。）2 2样本制备样本制备单细胞悬液的制备单细

10、胞悬液的制备血和骨髓：天然单细胞悬液。当有血凝块时，应用50um尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是否仍然存在。组织块：机械分离和酶分离两种方法。分离不仅是要获得最大产量的单细胞悬液还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性。 分离靶细胞群体分离靶细胞群体两种方法： 红细胞裂解：较佳。操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。 （最好在染色后溶血在染色前溶血，需确认：抗原性不被溶血过程改变，所用溶血剂不含固定剂） 度梯度离心：白血病细胞回收较好并可能得到富集，同时去除死细胞。（防止靶细胞的丢失。）估细胞悬液估细胞悬液样本外观：有严重溶血和血凝块的标本可能会有白细胞的损坏以及细

11、胞亚群的丢失或改变，应弃用。细胞丢失和分布：确认细胞形态和原始标本相似。密度梯度离心之后更应检查细胞分布。可做血涂片判断。细胞计数和浓度调整：厂家推荐的抗体浓度通常是假定靶细胞数量在正常范围内 (500,000-1,000,000testAb)。白细胞数量上的显著变化会带来染色模式的变化。 细胞活性：死细胞对许多抗体有非特异性染色。通过染色，活细胞将拒染这些染料。通过设门，可得到活细胞的染色 特性。（尤其适用于高度坏死的样本。） 细胞染色细胞染色细胞表面染色：免疫分型的抗原多在细胞膜上。（许多抗原也同时存在细胞内，注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。例如免疫球蛋白重链在细胞内和表面的存在有

12、着不同的意义，检测表面标记必须是未固 定的活细胞。）细胞内染色：有些胞内异性抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，（如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞浆内Ig的表达。胞内染色的关键是使细胞膜通透。） 胞膜和胞内的同时染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。（如，用于表面标记的荧光素应不被随后的固定和通透步骤所影响，而对于胞内染色，所用的荧光素应足够小能穿透到胞膜内。） 3. 3. 抗体组合的确定抗体组合的确定选择抗体组合的技术性考虑：1）基于血液肿瘤的复杂性，提供一个通用的抗体选择策略是不现实的。2）国际上迄今也没有一致性的抗体组合。 3）应该意识

13、到，没有一个的抗体组合可以解决所有的临床相关答案。4）一个局限性的小组合也可能影响对样本的正确评估和分类。5）确认细胞异常的能力与所用抗体的数量直接成正比。 选择抗体组合的基本原则如下选择抗体组合的基本原则如下1）所选的抗体组合应足够宽，抗体的数量越多，检测的灵敏度越高。2）抗体的选择应可以区分正常和异常细胞，正常细胞-内参照，异常细胞的表达比例-准确（如现在用CD45抗体来区 分正常和幼稚细胞，此方法尤其在幼稚细胞含量少时更显优势。）3）荧光强度和表位密度应同时考虑。4）必要时用活性检测排除死细胞较强的非特异性染色。（国外统计，约70%组织样本和48%血或骨髓标本有活性检测结果）5）实验人员

14、应了解所用抗体的反应细胞谱，以及与特定荧光素结合后的染色模式。相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式。常用的方案考虑常用的方案考虑1、大而全的抗体组合：全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但 费用高。2、先用筛查试剂了解样本的一般情况，再根据所得信息采用第二线特异性更高的抗体组。经济，但费时，（只有约30%国外实验室采用此法。）3、选用有目标性的抗体组合以 确认可疑的诊断或分类。 4.4.样本获取样本获取1、一般每个标本应获取1-2x104个有核细胞的荧光和散射光信号，2、微小残余病变分析则需5x104个细胞。3、恶性细胞常有较宽的 大小及范围，获取时最好收集无门的数据以保留所有未知异常

15、细胞群体的所有特性。4、免疫荧光信号要求对数放大和至少256的分辨率。（无论选择对数或线性放大都要以保证异常细胞都能被检测到。 ）5.5.数据分析数据分析1、多参数分析，（采用的参数越多，分析步骤越复杂，流式免疫分型的灵敏度越高。） 2、最少 的要求应是4个参数（2个光散射和2个荧光参数）。 分析技术：数据的分析方式随样本的特性、抗体组合及临床情况的不同而变化。总的原则：用多参数的数据可以区分正常和异常细胞的图形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, 等，散射光与荧光参数的综合分析常常能提供有效的信息。分析步骤：1、首先分析所有细胞的抗原表达情况，鉴别出正常细胞和异常细胞群体。2、

16、正常细胞的表现可以作为整个实验染色过程的内部 参照，提供实验一致性与否的客观证据。3、异常细胞则通过进一步设门分析确定表型特点。 设门1、选择特殊的细胞群体分析各个参数，把分析局限在门内的细胞群体。2、不同疾病的设门策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的设门方式在急性白血病中，CD45和SSC的双参数显示是鉴别幼稚细胞的一个简 单而有效的方法；在B细胞淋巴瘤中用一个全B细胞的抗体设门来看抗链和抗链的表现；在T细胞淋巴瘤时用一个全T细胞抗体设门使 肿瘤细胞的分型更加明确。通过的双参数分析区分多个区域的淋巴、单核和粒细胞群体。 分析异常细胞群体1、确定异常细胞群体后要进一步分析其免疫分型。分析

17、抗原表达要注意：定性的描述（阳性或阴性）只有在设门内细胞全部是感兴趣的细胞而且荧光分 布的形状可以非常清楚地区分阳性和阴性亚群的情况下，阳性百分率才有意义。某些抗原异质表达的群体中，可进行定性或定量 的分析（X% 幼稚细胞CDX阳性）；百分率也可用于描述异常和正常细胞的比例。2、评估抗原表达强度是分析的重要组成部分。特异的抗体的荧光强度是抗原密度的反映，同时也与所用的荧光素和独特的荧 光素抗体复合物有关。确认异常群体是因为没有表达应该表达的抗原，有时只能从抗原表达的异常强度来判断。（如用一些髓性抗原 CD14，CD33，CDw65的相对表达强度和散射光特征一起来确认单核细胞系和粒细胞系的发展成熟过程。）荧光强度的评估在大 多数情况下可以采用定性的资料。相同条件下相对 正常细胞的强度来表示。 （如CD45，CD8或CD38等在不同细胞上的表达密度相差几个对数范围，CD22或CD4等抗原则在所 谓阳性范围内在不同细胞类型上的区别较小）。3、区分弱阳性和阴性群体：在某