生物化学课件6核酸PPT课件

1、 概述 核酸的一级结构与序列分析 DNA的高级结构 DNA遗传物质 DNA的性质主要内容第1页/共96页 核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，在生物体内负责生命信息的储存和传递。 分类：按其所含戊糖不同分为DNA和RNA。 重要性：DNA是主要遗传物质，负责遗传信息的贮存和发布。 RNA的功能多样性，参与遗传信息的表达。1. 核酸的概念及研究进展第2页/共96页核酸研究史上的大事件 1868年，瑞士青年科学家 F.Miescher 从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离得到一种含磷较高的酸性物质，称之为核素（nuclein）。 1889年, Altmann 将其纯化，把不含蛋白质的物质称为核酸

2、第3页/共96页核酸研究史上的大事件1943年 E .Chargaff 的工作推理出碱基配对的理论1944年 Avery等肺炎球菌转化试验证明DNA是遗传物质 1953年 Watson-Crick 建立了DNA的双螺旋结构模型1958年 Crick 提出遗传信息传递的中心法则1968年 M.W.Niberg 发现遗传密码 1975年 H.M.Temin 和 D.Baltimore 发现反转录酶 1981年 W.Gilbert 和 F.Sanger 建立 DNA测序方法 1985年 PCR技术的发明 1990年 美国启动人类基因组计划( HGP ) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年

3、 美、英等国完成人类基因组计划基本框架第4页/共96页DNA：-D-2-脱氧核糖 A、G、C、TRNA：-D-核糖 A、G、C、U 核 酸（RNA、DNA）核苷酸磷酸核苷戊糖碱基核糖（RNA）脱氧核糖（DNA）嘌呤嘧啶腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶 2. 核酸的结构成分核酸的结构成分第5页/共96页戊 糖OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖DNA含脱氧核糖RNA含核糖第6页/共96页NNH132456 嘧 啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine, C)NNHNH2O尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶(thym

4、ine, T)NHNHOOCH3第7页/共96页嘌 呤(purine)NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤(adenine, A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤(guanine, G)第8页/共96页 核酸中除了5类基本的碱基外，还有一些含量甚少的碱基，称为稀有碱基。组成核酸的稀有碱基：Im5Chm5CDHUNNNNONNNH2OCH3次黄嘌呤5-甲基胞嘧啶5-羟甲基胞嘧啶二氢尿嘧啶 第9页/共96页碱基的酮式一烯醇式互变异构现象碱基的酮式一烯醇式互变异构现象正常生理条件下，主要以酮式结构形式存在。第10页/共96页核 苷 (ribonucleoside) 碱基和核糖（脱氧核糖）通过

5、糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）; 糖环上的第 1位C原子与嘌呤第9位N原子或嘧啶第1位N原子相连，碱基平面与戊糖平面互相垂直。OHOCH2OHOHNNNH2O11第11页/共96页胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2第12页/共96页嘧啶核甘中嘧啶碱基对核糖的取向只有反式构象嘌呤核甘中嘌呤碱基对核糖的取向有顺式和反式两种构象第13页/共96页 核苷（脱氧核苷）核苷（脱氧核苷）和磷酸以和磷酸以磷酸酯键磷酸酯键连接形成核苷酸连

6、接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。（脱氧核苷酸）。核苷酸 (ribonucleotide)POOOHOHOCH2OHOHNNNH2O第14页/共96页核糖核苷的糖环上有三个（5、3、2）游离的羟基，可以形成三种核苷酸；脱氧核糖核苷酸有两个（5、3）游离羟基，形成两种核苷酸。但天然的只发现5连接磷酸的核苷酸， 5 -核苷酸是核酸的基本单位。OBOH OHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸第15页/共96页核苷酸：AMP、GMP、UMP、CMP脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP 第16页/共96页核苷酸的

7、磷酸化核苷酸的磷酸化核苷一磷酸（ NMP ）核苷二磷酸（ NDP ）核苷三磷酸（ NTP ） ADPAMPATPNNNCHCCHNCOPOOPPOOOHHHOHOHHCCHOHOOHOHOHOCH2NH212354第17页/共96页 作为合成核酸的原料：如用ATP，GTP，CTP，UTP合成RNA，用dATP，dGTP，dCTP，dTTP合成DNA。 作为能量的贮存和供应形式：除ATP之外，还有GTP，UTP，CTP等。核苷酸的生理功能核苷酸的生理功能第18页/共96页 参与代谢或生理活动的调节：如环核苷酸cAMP和cGMP作为激素的第二信使。 参与构成酶的辅酶或辅基：如在NAD+, NADP

8、+, FAD, FMN, CoA中均含有核苷酸的成分。 作为代谢中间物的载体：用UDP携带糖基，用CDP携带胆碱，乙醇胺或甘油二酯，用腺苷携带蛋氨酸等。第19页/共96页核酸的结构基础 核苷酸残基通过与前一分子核苷酸3OH和后一分子核苷酸5磷酸基均形成3, 5 磷酸二酯键，这样鱼贯联结成链状聚合物； 包括250个核苷酸的短核苷酸链称为寡核苷酸；大于50个核苷酸的核苷酸链称为多聚核苷酸，即核酸。第20页/共96页3, 5 磷酸二酯键第21页/共96页自由的 5 磷酸基团自由的3 OH第22页/共96页A G P5 P T PG PC PT P OH 3 5 pApGpTpGpCpT-OH 3 5

9、 A G T G C T 3 书写及阅读方向：从5端（左侧）到3端（右侧），ApG 表示(A-3)- P (5-G) 。第23页/共96页 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA） 核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）:第24页/共96页DNA(脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸)RNA（核糖核酸）（核糖核酸）分布分布98%于细胞核中，于细胞核中，少量存于线粒体和少量存于线粒体和叶绿体中叶绿体中90%cell质中，质中，10%细胞细胞核中，核中，tRNA 15%，mRNA 5%, rRNA 80%生物生物功能功能遗传物质基础，储遗传物质基础，储存和传递遗传信

10、息存和传递遗传信息基因表达，指导蛋白质基因表达，指导蛋白质合成，生物催化合成，生物催化,有时有时RNA也是遗传物质也是遗传物质核糖核糖D2脱氧核糖脱氧核糖D核糖核糖碱基碱基A、C、G、TA、C、G、U磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸核酸的分布及功能第25页/共96页核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运

11、氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNA核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参

12、与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNARNA的分类及功能第26页/共96页 核酸的紫外最大吸收峰在波长260nm处 蛋白质紫外最大吸收峰在波长280nm处 纯DNA样品A260/A280比值为1.8 纯RNA样品A260/A280比值2.0以上紫外吸收特性可以鉴定核酸样品的纯度第27页/共96页一级结构是指在多核苷酸链中各个一级结构是指在多核苷酸链中各个核苷酸之间的连接方式、核苷酸的核苷酸之间的连接方式、核苷酸的种类、数量以及核苷酸的排列顺序。种类、数量以及核苷酸的排

13、列顺序。 2 第28页/共96页1. DNA一级结构：4种脱氧核苷酸dAMP、dGMP、dCMP、dTMP按照一定的排列顺序通过磷酸二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链。第29页/共96页 DNA碱基组成的特点:v具有种的特异性;v没有器官和组织的特异性；v年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成；v DNA的碱基组成符合碱基摩尔比例规律。第30页/共96页 DNA碱基摩尔比例规律 在各种DNA中，腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔数相等，即AT，鸟嘌呤与胞嘧啶 (包括 5-甲基胞嘧啶 )的摩尔数相等，即 G C + m5 C； 即嘌呤碱基的总摩尔数等于嘧啶碱基的总数： A + G T + C +

14、 m5C 这个碱基摩尔比例规律又称为DNA的碱基当量定律，Chargaffs rule。第31页/共96页2. DNA测序测序（sequencing） 核酸序列测定方法已经过近20年的发展，测序的具体方法种类繁多。但所依据的基本原理不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。第32页/共96页 将被测 DNA 制成单链模板，分别加入 4 个反应管中 在每个管中加入引物、缓冲液、DNA 聚合酶 和 4 种 dNTP（其中一种为32P标记）； 在 1、2、3、4 个管中分别加入 ddTTP、ddCTP、ddGTP 和 ddATP ，然后进行保温反应。 由于双

15、脱氧的 ddNTP 比正常的 dNTP 少了3-羟基，当它在 DNA 聚合酶作用下掺入到正在延伸的 DNA 链时，因 ddNTP 不含 3 -羟基，于是就阻止了其它 dNTP 的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。Sanger法的程序第33页/共96页双脱氧链终止法双脱氧链终止法第34页/共96页DNA的自动测序的自动测序第35页/共96页RNA一级结构：主要为4种核苷酸AMP、GMP、CMP 、UMP通过磷酸二酯键连接而成的没有分支的多核苷酸链，RNA 分子中还有某些稀有碱基。 RNA种类不同，结构各不相同。第36页/共96页1. mRNA的结构与功能的结构与功能 占细胞中RNA总量的35；

16、细胞内mRNA的种类很多，分子质量极不均一； mRNA是三类RNA中最不稳定的; 作为模板，直接指导蛋白质的合成。第37页/共96页真核真核mRNA 5 端的帽子结构端的帽子结构 7-甲基鸟苷三磷酸与 mRNA 原来的5端核苷酸连接形成m7GpppN。其作用是：vmRNA的稳定性维系：作为一种保护装置将mRNA 5端封闭起来，可使mRNA免受核酸外切酶的水解破坏；v翻译起始的调控：作为蛋白质合成起始的辨认信号，启动和加速翻译过程。v mRNA核内向胞质的转位第38页/共96页帽子结构第39页/共96页真核细胞的真核细胞的mRNA 3 末端的结构末端的结构 大多数真核细胞mRNA在3 末端有一个

17、长约 200个核苷酸的polyA; PolyA是在转录后经polyA聚合酶的作用添加上去的，原核生物的mRNA一般无3PolyA; 功能：与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关；与mRNA的半衰期即稳定性有关（新合成的mRNA其PolyA 链长，而衰老的mRNA其PolyA链较短）。第40页/共96页 tRNA皆由 7090 个核苷酸组成，有较多的稀有碱基；在三类 RNA 中它的分子质量最小。 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G也有pC的 2. tRNA的一级结构特点第41页/共96页3. RNA的测序的测序 利用酶的特异性，将RNA的特异核甘酸位点切

18、断后测序； 将RNA反转录成cDNA后再用DNA测序法测序。第42页/共96页 Watson 和 Crick 于 1953 年在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测，它是上世纪最重大的自然科学成就之一，1962年荣获诺贝尔化学奖。（一）（一） DNA的二级结构的二级结构第43页/共96页第44页/共96页1. DNA双螺旋结构的研究背景 碱基组成分析 Chargaff 规则：A = T G C 碱基的理化数据分析 A-T、G-C以氢键配对较合理 DNA纤维的X-射线衍射图谱分析 第45页/共9

19、6页2. DNA双螺旋结构模型要点 DNA分子由两条方向相反多聚脱氧核糖核苷酸链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。第46页/共96页2. DNA双螺旋结构模型要点 疏水碱基于螺旋的内侧，亲水的磷酸基和脱氧核糖以磷酸二酯键相连成的骨架位于外侧；双螺旋的直径为2nm，沿中心轴形成大沟和小沟交替出现第47页/共96页2. DNA双螺旋结构模型要点 碱基呈平面状，与中心轴垂直；相邻碱基平面间的距离为 0.34nm，夹角为36；每10对核苷酸绕中心轴旋转一圈，故螺旋的螺距为 3.4nm。第48页/共96页2. DNA双螺旋结构模型要点 两条链碱基对

20、之间形成氢键，碱基的相互结合具有严格的配对规律，即AT、GC配对。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。第49页/共96页第50页/共96页碱基配对第51页/共96页3. DNA双螺旋的稳定性双螺旋的稳定性 DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的,维持这种稳定性的因素包括：v 两条DNA链之间形成的氢键。v 碱基堆积力：由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。v 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力、范德华力等。v 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。第52页/共96页DNA双螺旋结构

21、DNA，双螺旋，正反向，互补链。 A对T，GC连， 配对时， 成氢键。 十碱基，转一圈，螺距34点中间。 碱基力和氢键，维持螺旋结构坚。 第53页/共96页DNA双螺旋结构的多样性Watson和Crick所提出的模型称为B-DNA, B型是最稳定的构型第54页/共96页反向重复序列反向重复序列(inverted repeats)回文序列回文序列(palindrome)第55页/共96页1957年发现在基因的调控区或染色质的 重组部位有DNA的三螺旋结构第56页/共96页 DNA的三级结构是指双螺旋进一步扭曲、折叠形成的更高层次的空间结构，也就是比双螺旋更为复杂的构象。 DNA的三级结构包括线状

22、DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋以及环状的结、超螺旋和连环等多种类型，其中超螺旋是最常见的三级结构。（二）（二）DNA的三级结构的三级结构第57页/共96页 正超螺旋 (positive supercoil) 处于拧紧状态时所形成的超螺旋(左手超螺旋) 负超螺旋 (negative supercoil) 处于拧松状态时形成的超螺旋 (右手超螺旋) 天然DNA中的超螺旋都是负超螺旋。第58页/共96页超螺旋超螺旋第59页/共96页 连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 扭转数（twisting number , T） DNA分子中

23、的Watson-Crick螺旋数目 超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W） L = T + W第60页/共96页三种环状分子具有相同结构，但L值不同，称为拓扑异构体。自然界存在的所有超螺旋DNA分子都是最初缠绕不足形成的负超螺旋第61页/共96页真核生物内，DNA以致密形式存在于细胞核的染色体中。染色体的基本单位是核小体核小体：DNA和组蛋白共同构成核心组蛋白：4种组蛋白(H2A , H2B , H3 ,H4)形成的8聚体DNA：以负超螺旋缠绕在核心组蛋白上H1在核小体之间起连接作用染色体的基本单位是核小体(nucleosome)第62页/共96页核小体的串珠状结构 第

24、63页/共96页 RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。（三）（三）RNA的高级结构的高级结构第64页/共96页发夹式结构 A-U, C-G配对 RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。第65页/共96页1. tRNA的二级结构的二级结构v呈“三叶草” 形状，一般可将其分为四臂四环：大致分为氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码子环、额外环和TC环五部分 。 第66页/共96页 2. tRNA的三级结构的三级结构tRNA三叶草结构进一步扭曲、折叠形

25、成倒写“”字母的三维结构。第67页/共96页tRNA的二级结构与倒结构三叶草结构第68页/共96页 3. rRNA的高级结构的高级结构 rRNA的种类（根据沉降系数）：真核生物： 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA原核生物： 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA第69页/共96页5S rRNA 与与16S rRNA第70页/共96页 间接证据 直接证据 原核与真核生物DNA的特点第71页/共96页间接证据间接证据v 特定的组织细胞的DNA数量是稳定的，随着组织的复杂，其数量逐渐增加;v 年龄、营养状况和环境的改变不影响DNA的数量和组成;v D

26、NA碱基的组成具有种的特异性。第72页/共96页直接证据直接证据|肺炎球菌的转化实验|噬菌体的感染实验 第73页/共96页原核生物与真核生物原核生物与真核生物DNA DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，即基因 (gene)。 细胞内染色体所包含的DNA总体称为基因组(genome)。第74页/共96页原核生物基因组结构特点原核生物基因组结构特点l基因组较小，形式多样，可能是DNA，也可能是RNA，可能是单链,双链的，闭环分子，线性分子；细菌染色体为环状双链DNA分子，与RNA和支架蛋白构成致密区域，称类核(nucleoid)。l功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一

27、个mRNA分子中，称为多顺反子(polycistron)。lDNA分子绝大部分用于编码蛋白质，非编码区通常包含控制基因表达的顺序。l基因重叠是病毒基因组的结构特点。第75页/共96页真核生物基因组结构特点单顺反子(monocistron)，即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子，一条多肽链;存在大量重复序列，包括卫星DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列;基因组中不编码的区域多于编码区域基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(intervening sequences)，称为内含子(intron)，编码区则称为外显子(exon)。基因组远大于原

28、核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。第76页/共96页 核酸的降解指通过核酸酶或物理、化学的方法使核酸的3, 5磷酸二酯键断裂，多聚核甘酸链变成小段寡聚核甘酸链。1. 降解与变性振荡、搅拌、反复冻融等易导致DNA的降解第77页/共96页 指DNA分子由稳定的双螺旋结构，松解为单链无规则线性结构的现象。 DNA的变性只涉及维持双螺旋稳定性的次级键的断裂，一级结构并不改变。 凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如过量酸，碱，加热，变性试剂（尿素、酰胺）以及某些有机溶剂（乙醇、丙酮、尿素等）DNA的变性第78页/共96页 变性后的 DNA生物活性丧失，同时发生一系列

29、理化性质的改变，包括： 粘度下降； 沉降系数增加； 比旋下降； 紫外光吸收值升高等。第79页/共96页DNA的变性第80页/共96页 酸碱变性v低或高的pH值条件趋向影响DNA双螺旋中氢键的形成，导致DNA的变性。 低离子浓度v双链DNA浓度过低，带正电荷的物质减少导致DNA 上带负电荷的磷酸基团部分脱防护，使相连的磷酸基团相互斥力增加，使DNA双链分离。第81页/共96页 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，50%的DNA分子发生变性时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。一般DNA的Tm值在82-95C之间 热变性第82页/共96页 G和C的含量高，Tm值高：因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3) 2.44 Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发