融合蛋白表达实验报告

1、基因构建与表达实验报告实验一 目的基因扩增与纯化回收一、聚合酶链式反应实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。实验原理：DNA双螺旋在90-95解链形成单链；50-55引物与单链结合；70-72TaqDNA聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从53方向合成新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器和材料：PCR仪 PCR管 移液器 tip枪头实验试剂： 双蒸水（ddH2O） 10×PCR缓冲液(含Mg2) 4种10×dNTP 混合 Taq酶（Easy Taq）DNA模板两种引物（上游和

2、下游） 实验步骤：1、 配制PCR反应体系试剂ddH2OEasy Taq BufferdNTPEasy Taq酶甘油上游引物下游引物DNA模板100ul大体系6510100.210222注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配体系分装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板2、 放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下： (1) 94预变性4min； (2) 94变性1min； (3) 55退火1.5min； (4) 72 延伸2min； (5) 重复(2)-(4)30个循环；（6

3、）72 终延伸10min；二、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。实验仪器：电泳仪、 紫外检测仪、 水平电泳槽、移液枪、 一次性手套实验试剂： TAE 、EB溶液

4、、凝胶加样缓冲液、 琼脂糖实验步骤：1、 1%琼脂糖凝胶的制备（以制备5块胶为例）：（1）称取琼脂糖1.6g，加入160ml 1 x TAE缓冲液，在微波炉上加热溶解煮沸熔化，取出摇匀至无沉淀。（2）取有机玻璃内槽，放置于水平位置，用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。冷却到60左右（手感温度不烫手即可）加入7ulEB溶液，摇匀后倒入有机玻璃内槽，等距插入5个样品梳子。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液没过胶面。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点3ul缓冲液在点样板上，再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液混匀后，加入样品孔中，并记录好点样顺序。（大体系PCR产

5、物需要回收，点样时更换枪头避免交叉污染）3、电泳及结果观察接通电泳槽与电泳仪的电源，170V恒压电泳20min，电泳至溴酚蓝接近胶底部边缘即可；电泳完毕，取出凝胶，放在紫外灯下观察DNA条带的位置，根据DNA条带与溴酚蓝的相对位置估算DNA分子量大小，记录结果。三、DNA片段回收：1、摇匀GS树脂，用移液枪取500ul树脂分装于1.5mlEP管中，将PCR大体系产物加入到GS树脂中，用移液枪吹打混匀，静置10min，让片段结合到GS树脂上2、将混合液转入纯化柱中，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体3、加600ul80%异丙醇洗脱两次，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体，13000r

6、pm空甩20min ；取出回收柱放入干净的1.5mlEP管中，放入30-40摄氏度烘箱烘干10min左右，使异丙醇完全挥发。4、取出加入50ul ddH2O浸润树脂干粉，静置10min让ddH2O充分浸润树脂干粉， 13000rpm离心2-3min，得到的PCR产物用于双酶切。实验结果：序号引物号100ul大体系20ul小体系片段大小1P182793272P182803393P182813784P182823215P182835526P182842317P182852228P18286×3279P1828750110P18288××52811P1829047112

7、P1829135113P1829218614P1929364515P18295××87316P1829661217P1829724318P1829841719P1829990320P1830024921P1830228522P1830330023P1830430624P1830534525P1828918626P18274489实验二 DNA双酶切及酶切产物纯化实验目的：通过DNA限制性内切酶对DNA双链进行双酶切，使DNA片段露出相应的粘性末端。实验原理：1、核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统

8、，用于抗击外来DNA的侵袭，具有自我保护机制。一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，切割DNA分子。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响酶切反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。2、型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，其优点是：只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需要Mg2+参与，无需ATP。3、DNA双酶切可有效防止载体自连形成空载体，双酶切应选择公用的Buffer实验仪器和材料：PCR仪

9、、PCR管、移液枪、tip枪头、限制性内切酶实验步骤：取5ul通用酶切buffer Tango，加入1ul限制性内切酶1和1ul限制性内切酶2，将PCR回收产物全部（大约43ul）加入混匀，体系配好后盖上PCR管并做好编号，放入PCR仪中，设定37酶切过夜。用含有GS结合液的树脂纯化酶切产物，操作方法同PCR产物回收方法。序号引物号酶切位点1酶切位点2Buffer1P18279EcoRXholTango2P18286EcoRXholTango3P18292EcoRXholTango4P18299EcoRXholTango5P18280BamhXholTango6P18281BamhXholTa

10、ngo7P18282BamhXholTango8P18283BamhXholTango9P18284BamhXholTango10P18285BamhXholTango11P18287EcorXholTango12P18290BamhXholTango13P18291BamhXholTango14P18293BamhXholTango15P18296BamhXholTango16P18297BamhXholTango17P18298BamhXholTango18P18300BamhXholTango19P18302BamhXholTango20P18303BamhXholTango21P183

11、04BamhXholTango22P18305BamhXholTango23P18289BamhXholTango24P18274BamhXholTango实验三 目的基因与载体连接实验目的：将外源 DNA 片段与线状质粒载体连接，构建具有目的基因的质粒载体。实验原理：在Mg2+和ATP存在下， DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端连接成重组DNA分子。T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；酶-AMP复合物结合到相邻的具有 5'磷酸和 3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化，形成一个新的磷酸二酯键，将切口封闭。实验仪器与材料：PCR仪、

12、PCR管、移液枪、tip枪头、T4连接酶Buffer、T4 DNA连接酶、pet-28a载体、pGEX-4T载体实验步骤1、配制连接反应体系，按顺序向微量PCR管中依次加入：10×T4连接酶buffer 1ulT4连接酶 1ulPEGX载体/PET28a载体 1ul纯化后酶切产物 7ul2、体系配好后放置于PCR仪中，22保温4h。第一批连接重组22个PGEX-4T E+X18279、18292、18299PGEX-4T B+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290pet28a E+X18279、18292、18299pet28

13、a B+X18280、18281、18282、18383、18284、18285、18287、18290第二批连接重组24个PGEX-4T B+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274pet28a B+X18291、18293、18296、18297、18298、18300、18302、18303、18304、18305、18289、18274实验四 重组子转化试验目的: 将含有目的基因的重组质粒转化入大肠杆菌中。试验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫做感受态。细菌在0 CaCl2低渗

14、溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。细菌处于0 CaCl2低渗溶液中，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物粘附于细胞表面，经过42°C 90S热击处理，促进吸收DNA复合物。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗药性基因表达，即可在含Amp或Kan的培养基中生长。从而筛选出重组子，即带有外源DNA分子的受体细胞。实验仪器与材料：超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-80冰箱、恒温水浴锅胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(Nacl)、氨苄青霉素、感受态DE3（BL21）、pet-28a载体、pGEX-4T载体、1.5mL离心管、移液枪、试管、

15、培养皿等试剂准备：（1） SOB培养基200ml：蛋白胨4g、酵母粉1g、NaCl 0.1g，加水定容至200ml，调节 pH 7.0（2） LB固体培养基：1%NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.5%琼脂粉，培养基放入121湿热灭菌20min。（3）抗生素：卡那青霉素，氨苄青霉素实验步骤：1、连接完成的重组质粒，在PCR仪中65灭活10min2、从-80冰箱中取2支感受态细胞，在酒精灯火焰下，分装80ul感受态于1.5mlEP管中，并加入10ul重组质粒混匀，冰浴30分钟。3、于42恒温水浴锅中热激90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴5min4、每管加入800 ulSOB、16ul

16、Glu、4ulMgCl2，37 150rpm摇床培养50min。5、8000rpm离心5min，倒掉部分上清，在超净工作台中将吹打混匀后培养物涂布于含Amp或Kan的LB琼脂平板上。6、在37培养箱中将平皿倒置，培养过夜12-16h。实验结果：在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pGEX-4T重组载体的大肠杆菌，在含卡那青霉素的培养基上生长的菌落即为含有pet-28a重组载体的大肠杆菌。两批实验连接的18304构建Amp和Kan抗性平板上均未长，可能是酶切错误导致。后重新PCR、酶切重连，转化筛选呈阳性，但未表达。实验五 重组子筛选和接种实验目的：从单抗菌落中筛选出阳性克隆实验原理：带有

17、目的基因的单克隆菌落在，在高温下（95）裂解释放出目的基因的质粒，通过PCR扩增目的基因，从而达到检测的目的。实验仪器和材料：恒温培养箱、PCR仪、电泳仪、 紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套、LB固体培养基、牙签，PCR扩增试剂等实验步骤：1、取相应抗性的平板，在平板上画格子；配制PCR反应体系2、取出过夜培养的平板，每个菌筛选5个单克隆菌落在平板格子内画线，画线的牙签放入配好的20ul体系中涮洗，涮洗过牙签的体系放入PCR仪中进行扩增，画线的平板放在37培养箱中倒置培养4h。3、PCR完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测筛选结果。实验结果：第一批筛选结果记录序号引物号氨苄青霉素抗性卡那青

18、霉素抗性1P182793、4、51、2、42P182801、2、3、4、51、4、53P182811、4、5-4P182823、4、51、2、3、4、55P182831、3、4、5-6P182841、2、3、4、52、3、4、57P182851、2、3、51、2、3、48P182871、2、3、51、2、59P182901、3、4、52、3、4、510P182991、2、4、51、311P182921、2、3、4、54、5第二批筛选结果记录序号引物号氨苄青霉素抗性卡那青霉素抗性1P182911、3、1、32P18293-2、43P182961、21、2、3、4、54P182973、41、25P

19、182984、52、36P183003、41、2、57P183022、3、4、52、3、48P183032、3、4、51、2、4、59P18304平板未长平板未长9P183052、32、3、4、510P18289-3、411P182741、2、3、4、51、2、3、4、5小样接种挑取两个阳性克隆菌落，接种于4ml液体LB抗性培养基中，37 220rpm摇床过夜培养，两批接种信息如下：序号名称序号名称序号名称序号名称1+18279-3/-412+K18279-1/-21+18291-1/-312+K18291-1/-32+18280-1/-213+K18280-1/-42+18293-1/-21

20、3+K18293-2/-43+18281-1/-414+K18281-1/-23+18296-1/-214+K18296-2/-34+18282-3/-415+K18282-1/-24+18297-3/-415+K18297-1/-25+18283-1/-316+K18283-1/-25+18298-4/-516+K18298-2/-36+18284-1/-217+K18284-2/-36+18300-3/-417+K18300-1/-27+18285-1/-218+K18285-1/-27+18302-2/-318+K18302-2/-38+18287-1/-219+K18287-1/-28

21、+18303-2/-419+K18303-1/-29+18290-1/-320+K18290-2/-39+18305-2/-320+K18305-2/-310+18299-1/-221+K18299-1/-310+18289-1/-221+K18289-3/-411+18292-1/-222+K18292-4/-511+18274-1/-222+K18274-1/-2实验结果：小样接种菌生长良好，无未长现象。实验六 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与制样实验目的：检测阳性克隆的表达情况实验原理：1、Ecoli Lac操纵子包括Z、Y、A三个结构基因，以及启动子P、控制子O、阻遏子I。LacI基因

22、编码一种阻遏蛋白，其与操纵序列O结合，使基因表达处于关闭状态。2、在没有乳糖存在时，Lac操纵子处于阻遏状态，此时I序列在启动子的作用下表达阻遏蛋白，并与O序列结合，抑制转录的起始；当有乳糖存在时，Lac操纵子即可被诱导，真正的诱导剂并非乳糖本身，乳糖进入细胞后，在-半乳糖苷酶作用下转变为半乳糖，后者作为一种诱导剂结合阻遏蛋白，从而使RNA聚合酶能顺利地与控制子结合并移动，使LacZ、Y、A基因得以表达。3、异丙基巯基半乳糖苷（IPTG），是一种乳糖类似物，因为不是半乳糖苷酶的底物，所以不能被细胞利用，从而实现持续表达。实验仪器和材料：恒温摇床、玻璃试管、超净工作台、低温离心机、湿热灭菌锅、含

23、外源基因表达栽体的E.coli、酵母粉、胰化蛋白胨(tryptone)、氯化钠(Nacl)、甘油、氨苄青霉素、卡那青霉素、IPTG、移液枪、tip枪头实验步骤：1、取200ul培养过夜的菌种，接种于新的4mLLB抗生素培养基中2、于37恒温摇床，200r/min培养1.5h后，加入 30l IPTG ，继续培养3.5小时。3、取1.5ml菌液， 8000rpm，低温离心5min，收集菌体弃上清，加入SDS Buffer100ul，用牙签搅碎菌体，放在沸水中煮沸1.5-2h，于4°C冰箱中保存。实验结果：扩大接种和诱导培养，无变清现象，菌体生长良好。实验七 Western-blot检测

24、表达蛋白实验目的：蛋白经SDS-PAGE后进行Western-blot检测，鉴定目的蛋白的表达情况实验原理：1、SDS-PAGE电泳分离蛋白质，是基于各蛋白组分在凝胶中的迁移率主要取决于分子大小和形状，及其所带电荷的多少。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS，SDS与蛋白分子结合，使其带上相同密度的负电荷，其数量远远超过蛋白分子原有的电荷量，从而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差异，因而蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于分子量大小。2、Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质，利用抗体作为“探针”，用二抗标记“显色”。经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（

25、例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测目的基因表达的蛋白成分。实验步骤：一、SDS-PAGE电泳1.配制分离胶配制12%和14%分离胶 按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中：凝胶浓度（%）1214分离胶buffer4ml4ml40%gel2ml2.2ml双蒸水2ml1.8mlTEMED8ul8ul10%Aps80ul80ul总体积8ml8ml不同浓度的凝胶的成分和用量 根据被分

26、离的外源蛋白的相对分子量选择凝胶浓度，先洗净玻璃架好制胶架，装满水静置一段时间，不漏水为宜；将所有成分混匀后加入两玻璃夹缝中，胶面离小玻璃上端1cm左右，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约30min等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水沥干。2.4%浓缩胶的配置 按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中：4 %分离胶的配制成分成分用量压缩胶buffer1.5ml40%gel0.3ml双蒸水1.2mlTEMED4ul10%Aps40ul总体积3ml混匀后，立刻转移到玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平，并在两玻璃夹缝中快速斜插入15孔的梳子，溶液凝固后小心拔出梳子。3.上样 氨苄抗性加

27、10ul，卡那抗性加15ul，marker加样量随样。4.电泳 接好电极，将电压调至80V，待溴酚蓝移到分离胶后（约20min），在将电压调至120V，当溴酚蓝移到玻璃距底部即将全部跑出时切断电源，总用时大约90min。二、转膜（1）将上层滤纸、下层滤纸分开浸泡于transfer buffer中，用镊子将编号的PVDF膜放在甲醇中浸润2-3min后浸泡在transfer buffer中。（2）在半干转移仪阳极面铺好下层滤纸；将膜铺在下层滤纸上，不要产生气泡，倒少量Buffer于膜上，保持膜的湿润；将胶取出，切掉上层胶，小心将胶铺在膜上，赶走气泡；将上层滤纸覆盖在胶上，按住一端，用滚轮赶走多余的

28、液体。（注意滤纸与膜、膜与胶之间不能有气泡）（3）盖上电极盖子，接通电源，每张膜恒流60mA，转移40min。三、蛋白印迹1、封闭位点 转移结束前配好5%TBST牛奶，转移完毕后将膜放入甲醇浸泡，然后晾干使膜完全疏水2、加一抗孵育 每个盒子放两张膜，背面相贴而放，加30ml5%TBST牛奶封闭位点，按1:8000加GST、His抗体孵育1h3、洗涤 孵育完后，用TBST快洗三次，再在转摇床洗5次，每次5min，洗掉牛奶。4、DAB显色 取一管DAB加入15ul过氧化氢，将洗涤后的膜放入染色10min左右5、用自来水清洗膜数次后，晾干观察。实验结果：第一批连接Western-blot结果图182

29、79-4 K18279-118280-1 K18280-118282-3 K18282-118283-1 K18283-118284-1 K18284-218285-1 K18287-218290-1 K18290-318299-1 K18299-118292-1 18287-1质粒转Rose呈阳性第二批连接Western-blot结果图 重连Western-blot结果图18293-2 K18293-2 18287-118296-2 K18296-2 18291-118298-4 K18298-2 18297-118300-4 K18303-1 K18289-118274-2 K18274-

30、1 18303-118289-1 18286-118305-2膜1膜2泳道上样信息上样量分子量kDa结果上样信息上样量分子量kDa结果118279-310ul38×18287-110ul45×2-410ul38偏高-210ul45×3Marker10ulMarkerMarker18290-110ul44418280-110ul39Marker10ulMarkerMarker5-210ul39-310ul44618281-110ul41×18299-110ul607-410ul41×-210ul60818282-310ul3818292-110u

31、l339-410ul38×-210ul33×1018283-110ul4718227-310ul3711-310ul4718151-110ul371218284-110ul3418170-110ul3413-210ul3418176-110ul37×1418185-110ul34偏高15-210ul34偏高膜3膜4泳道上样信息上样量分子量kDa结果上样信息上样量分子量kDa结果1K18279-110ul18K18287-110ul252-210ul18-210ul253K18280-110ul19K18290-210ul244-410ul19-310ul245Ma

32、rker10ulMarkerMarkerK18299-110ul406K18281-110ul21×Marker10ulMarkerMarker7-210ul21×-310ul408K18282-110ul1818292-410ul13×9-210ul18×-510ul13×10K18283-110ul27K18176-210ul17偏低11-210ul2712K18284-210ul1413-310ul1414K18185-110ul14×15-210ul14×第一批Western-blot结果记录膜1膜2泳道上样信息上样

33、量分子量kDa结果上样信息上样量分子量kDa结果118291-110ul40×18303-210ul372-310ul40×-410ul373Marker10ulMarkerMarker18305-210ul38418293-110ul49GSTMarker10ulMarkerMarker5-210ul49-310ul38×618296-110ul4818289-110ul337-210ul48-210ul33818297-310ul35×18274-110ul449-410ul35×-210ul441018298-410ul4118176-1

34、10ul37×11-510ul41K7227-110ul43×1218300-310ul35-210ul43×13-410ul351418302-210ul37×15-310ul37×膜3膜4泳道上样信息上样量分子量kDa结果上样信息上样量分子量kDa结果1K18291-110ul20×K18303-110ul172-310ul20×-210ul173K18293-210ul29K18305-210ul18×4-410ul29-310ul18×5Marker10ulMarkerMarkerK18289-3

35、10ul13×6K18296-210ul28Marker10ulMarkerMarker7-310ul28-410ul13×8K18297-110ul15×K18274-110ul249-210ul15×-210ul2410K18298-210ul2111-310ul2112K18300-110ul15×13-210ul15×14K18302-210ul17×15-310ul17×第二批Western-blot结果记录实验八 质粒的提取与鉴定实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理及各种试剂的作用，并对所提质粒进

36、行PCR鉴定实验原理：微量碱裂解抽提质粒，是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异。在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。当以高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA复性保留在溶液中，而大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，通过离心形成沉淀去除。然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。实验仪器及材料：含有质粒的大肠杆菌菌液、离心机、移液器、质粒小提试剂盒（用前溶液加入RNA酶混匀）实验步骤: 一、提取质粒1、将50ul菌液接种到6ml含相应抗生素的LB液体培养基

37、中37震荡培养过夜；2、取2ml培养物倒入微量离心管中，10000r/min离心2min；3、重复步骤2一次，倒去去培养液，吸干，使细胞沉淀尽可能干燥；4、加250l溶液，旋涡震荡悬浮菌体，加250l的溶液，轻轻上下颠倒混匀，不超过5 min。 加350l的溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温放置5 min。5、13000r/min，离心20min，将上清转至纯化柱中13000rpm瞬时离心。6、向纯化柱中加50ulHBC，13000r/min，离心1min，弃下清液。7、加700ul的DNA Wash Buffer，13000r/min，离心1min，弃下清液。8、重复步骤8一次。13000r/mi

38、n，空转离心2min，取出柱子放在干净的1.5mlEP管中，放在烘箱里面烘10min。9.加50ul双蒸水在滤膜上，室温下静置2min，13000r/min，离心1min，收集的质粒放在-20冰箱中保存。二、质粒鉴定（PCR）体系同PCR小体系，鉴定结果为阳性的质粒为：18279-4 K18279-1 18293-2 K18293-2 18287-118280-1 K18280-1 18296-2 K18296-2 18291-118282-3 K18282-1 18298-4 K18298-2 18297-118283-1 K18283-1 18300-4 K18303-1 K18289-1

39、18284-1 K18284-2 18274-2 K18274-1 18303-118285-1 K18287-2 18289-1 18286-118290-1 K18290-3 18305-218299-1 K18299-118292-1实验总结及结果讨论一、 实验总结考核实验共扩增引物号26个，阳性24个；连接转化分两批进行，第一批连接重组22个，表达呈阳性且质粒鉴定正确的有17个，第二批连接重组24个，表达呈阳性且质粒鉴定正确的有12个，后期改变条件重连21个，表达呈阳性且质粒鉴定正确的有6个；考核实验最终给菌35个。二、 结果与讨论1. 基因扩增（PCR）：实验结果：第一批PCR大体系

40、扩增26个引物号，结果呈阳性的23个，阴性3个分别是P18286、P18288、P18295；后改用20ul小体系重新扩增P18286、P18288、P18295，结果只有P18286呈阳性，并取P18286小体系PCR产物5ul作为模板扩增100ul大体系，结果仍为阳性。原因分析：大体系与小体系试剂配比基本相同，不同的是上下游引物和模板的相对量，20ul小体系上下游引物和模板分别加1ul，比大体系的相对量多，因此PCR效率较高；P18288、P18295 PCR呈阴性，可能是模板的问题（浓度不够含量较低、含杂蛋白等抑制物）、PCR反应条件的问题（退火温度高影响引物与模板的结合、延伸时间太短）、靶序列发生突变或缺失影响引物与模板特异性结合、引物设计不合理，与模板结合的特异性较差。改进措施：第一次PCR结果为阴性时，首先核对所用模板是否正确；可以尝试先扩增小体系，以小体系为模板扩增100ul大体系；降低引物量，适当增加模板用量，对模板进行纯化；适当降低退火温度，增加延伸时间；必要时重新设计引物，更换更保守、特异性更高的引物。2.连接重组与转化实验结果：大部分转化菌在相应抗性平板上生长良好，菌落数能达到要求；其中18304在两次的连接转化后，Amp和Kan抗性平板均未长，后重做PCR、酶切后再次连接，转化后Amp和Kan