标记免疫技术PPT课件

1、标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术第1页/共88页标记免疫技术免疫测定技术免疫组化技术示踪物及标记技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术化学发光技术金免疫技术 第2页/共88页第八章第八章 放射免疫技术放射免疫技术 类型：类型： 放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA） 广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。 特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等

2、第3页/共88页标记物:常用的核素有两大类射线： 131I、125I、57Cr和60Co射线：14C、3H和32P。使用最广泛的是：125I 性质活泼、易制备标记物 对被标记物的免疫活性影响小 测量方法简便、已推广 半衰期较长、核素丰度高第4页/共88页标记方法125I的标记原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上的氢原子方法： 直接标记法 氯胺T法和乳过氧化物酶法 间接标记法 联接标记法第5页/共88页适用分子 原理特点缺点直接标记 肽类、蛋白质、酶存在酪氨酸、组胺残基等基团操作简便、易标记、比放射性高不适于活性功能区的残基标记间接标记 甾类化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、组胺

3、残基等基团,需添加可避免氧化还原剂对被标记物活性的损伤等添加基团可能影响被标记物活性第6页/共88页标记物纯化 对游离的125I等试剂与标记物进行分离 方法：分子筛凝胶过滤；离子交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；高效液相色谱（HPLC）第7页/共88页标记物鉴定放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性占总放射性的百分率。一般要求大于95。免疫活性 标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T80， B/T 抗原损伤。比放射性 单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。 比放射性 方法更灵敏；过高 辐射自损伤大，对标记物免疫活性影响

4、大，储存稳定性差 。第8页/共88页抗血清鉴定 多克隆抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂之一，其质量直接影响方法的特异性和灵敏度。亲合力 选用亲和常数K值大(1091012 L/mol)抗血清特异性 其程度可直接影响结果的准确性 滴度 最大稀释度。在本技术方法中是指结合50标记抗原时的抗血清的稀释度。第9页/共88页放射免疫分析（ RIA ）基本原理 采用定量的标记抗原（Ag）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。第10页/共88页第11页/共88页第12页/共88页 以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F与Ag的量变存在着函数关系。B/F 60() 5

5、0 40 30 20 10 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 Ag(ng/ml) 第13页/共88页测定方法与步骤1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法2.分离结合与游离标记物 沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作简便，重复性好且经济。 3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(射线)或液体闪烁计数仪( 射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。 第14页/共88页免疫放射分析（IRMA）基本原理 单位点IRMA： 利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后

6、，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。第15页/共88页第16页/共88页双位点IRMA 先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。第17页/共88页第18页/共88页IRMA与RIA的异同点 标记物标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。 反应

7、速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。第19页/共88页 反应原理 RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的直线关系。 特异性 在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。 检测范围 通常RIA的工作范围为2-3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。 第20页/共88页 分析误差 RIA中

8、加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。 其他 RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在RIA中应用的为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。 第21页/共88页放射免疫技术的应用 常用于各种激素、微量蛋白、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。 问题：放射性污染、常用核素半衰期短、试剂盒稳定期不长不易自动化

9、仪器分析等。第22页/共88页第九章 免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。 是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 第23页/共88页基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。第24页/共88页第一节 荧光的基本知识第25页/共88页异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）

10、为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为，最大为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为，最大吸收光波长为吸收光波长为490-495nm490-495nm，最大发射光波长，最大发射光波长520-520-530nm530nm，呈现明亮的，呈现明亮的黄绿色荧光黄绿色荧光，是应用最广泛的，是应用最广泛的荧光素。荧光素。主要优点：主要优点：人眼对黄绿色较为敏感；人眼对黄绿色较为敏感；通常切通常切片标本中的绿色荧光少于红色，片标本中的绿色荧光少于红色，降低背景干扰 。第26页/共88页第27页/共88页四乙基罗丹明（四乙基罗丹明（RB200RB200） 为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精

11、和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为光波长为570nm570nm，最大发射光波长为，最大发射光波长为595595600nm600nm，呈，呈橘红色荧光橘红色荧光。常用于双重标记或对。常用于双重标记或对比染色。比染色。 第28页/共88页四甲基异硫氰酸罗丹明（四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITCTRITC） 最大吸引光波长为最大吸引光波长为550nm550nm，最大发射光波，最大发射光波长为长为620nm620nm，呈，呈橙红色荧光橙红色荧光。其异硫氰基可与。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。蛋白质结合，但荧光效率较低。 第29页/共88页 荧

12、光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对荧光有猝灭作用，因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。第30页/共88页荧光抗体的制备荧光抗体的制备 作为标记的荧光素应符合以下要求作为标记的荧光素应符合以下要求： 应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 标记方法简单、安全无毒。第31页/共88页荧光

13、抗体是将荧光素（如FITCFITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。 标记方法：搅拌法(适合大样品) 透析法(适合小样品)标记抗体的纯化：透析法 层析分离法 第32页/共88页荧光抗体的鉴定荧光抗体的鉴定F/PF/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A A280280，分别测读A A280280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰 第33页/共88页F/PF/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以为宜，用于活细胞染色的以为宜。 第34页/共88页抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想 抗体特异

14、性 ：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光 第35页/共88页第二节 免疫荧光显微技术基本原理：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。 第36页/共88页直接法直接法 荧光抗体染色第37页/共88页直接法优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少，缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体第38页/共88页间接间接法法 第39页/共88页间接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。第40页/共88页免

15、疫荧光技术在医学检验中的应用 在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。 免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一。 用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。 在寄生虫感染诊断中，间接免疫荧光试验（IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。 第41页/共88页 免疫荧光法还是检测自身抗体的好工具，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分，并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。 荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析（flowcytometry）。可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更常用于T细胞亚群等的检

16、测。 第42页/共88页第十章第十章 酶免疫技术酶免疫技术 第43页/共88页第一节 酶免疫技术概述基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 第44页/共88页基本特点： 标记后保留酶和抗原(抗体)的活性 酶促反应专一性，保证特异性 底物反应放大作用，提高敏感性 酶标试剂保存稳定 操作简便，安全易行第45页/共88页主要试剂的制备与要求第46页/共88页一、酶与酶作用底物（一）用于标记酶的要求： 酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助

17、因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉第47页/共88页（二）常用酶及其底物1.辣根过氧化物酶（HRP） 常用底物： 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。第48页/共88页第49页/共88页2. 碱性磷酸酶（AP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。 * AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率 低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。第50页/共88页二、酶标记抗体或抗原 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生

18、产和分离纯化第51页/共88页 酶标记方法 1.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。2.直接法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。第52页/共88页三、固相载体 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。第53页/共88页 固相载体的种类与选择1.塑料制品 材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。2.微颗粒 结合容量大，反应迅速，逐渐普遍用于自动化分析。3.膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤

19、膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA。第54页/共88页四、免疫吸附剂原理：非共价键吸附或共价键化学偶联（包被）。一般采用偏碱性（pH9.6）的碳酸盐溶液（ELISA板）。封闭：15牛血清白蛋白或520小牛血清。第55页/共88页 酶免疫技术的分类 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定第56页/共88页 均相酶免疫测定Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E 基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原

20、理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。第57页/共88页异相酶免疫测定（enzymeimmunoassay,EIA） 基本原理：在抗原抗体反应后，先将抗原抗体复合物与游离的酶标抗体分离，再测定酶标记的复合物催化底物显色的活性，最后推算出样品中抗原的含量。液相EIA：分离剂分离游离的和结合的标记物。固相EIA：固相载体结合酶标复合物，经洗涤去除游离的酶标抗体。如ELISA。Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E第58页/共88页第二节 酶联免疫吸附试验enzyme linked immunosorbent assay(

21、ELISA) 第59页/共88页基本原理：基本原理： 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性保持其免疫活性 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应相载体表面的抗原或抗体起反应第60页/共88页用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。标本中

22、受检物质的量成一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析据颜色反应的深浅进行定性或定量分析第61页/共88页ELISAELISA技术类型：技术类型： ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3 3种必要种必要的试剂：的试剂：v固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，v酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，v酶作用的底物。酶作用的底

23、物。 第62页/共88页第63页/共88页1双抗体夹心法第64页/共88页第65页/共88页特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 第66页/共88页2 2间接法间接法 第67页/共88页第68页/共88页 第69页/共88页特点： 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标

24、记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。第70页/共88页4.捕获法（反向间接法） 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。 基本原理： 固相抗IgM待检标本(IgM)抗原(与特异抗体结合)酶标抗体底物第71页/共88页 第三节 膜载体的酶免疫测定 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝酸纤维素膜。类型：免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式 斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫

25、印迹法 (Western blot) 第72页/共88页免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT） 亦被称为Western blot分三个阶段进行 :SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电转移 酶免疫定位 第73页/共88页 SDS-PAGE 抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带） 第74页/共88页第75页/共88页 电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1-2A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离

26、的蛋白质条带肉眼仍不可见。 第76页/共88页 酶免疫定位 将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDA-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量。 第77页/共88页第78页/共88页第79页/共88页第四节 酶免疫测定的应用第80页/共88页病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。病毒如肝炎病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。病毒如肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。如弓形体、阿米巴、疟原虫等。蛋白质如各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例蛋白质如各种免疫