大肠菌群的检测

1、大肠菌群的检测大肠菌群的检测大肠菌群的定义大肠菌群的定义: 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群基本形态：大肠菌群基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多

2、数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。实验原理实验原理 大肠菌群指一群能大肠菌群指一群能发酵乳糖发酵乳糖、产酸产气产酸产气、需需氧和兼性厌氧氧和兼性厌氧的的革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。品有否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌检样内大肠菌群最可能数（群最可能数（MPN）表示。表示

3、。实验器材实验器材 蒸汽灭菌物品：蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵培养基试管10支 2.9mL蒸馏水试管5支 干热灭菌物体：干热灭菌物体： 10mL移液管1支 1mL移液管5支实验试剂实验试剂乳糖胆盐发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚指示液25mL乳糖 10.0g 牛胆盐5.0g 水1000mL除0.04%溴甲酚指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值为7.2-7.6，加入0.04%溴甲酚指示液，根据要求的用量分装于含倒管的试管中，灭菌。麦康凯琼脂培养基麦康凯琼脂培养基大肠菌群及大肠杆菌测定 MPN法检验流程实验内容与步骤实验内容与步骤1）检样稀释）检样稀

4、释（无菌操作）无菌操作）将将25mL（或或g）检样置于含检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用800010000r/min的速度处理的速度处理1 min）制成制成1：10的均的均匀稀释液。匀稀释液。用用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀释液稀释液1mL，注入含有注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的的稀释液。稀释液。另取另取1mL灭菌试管，按操作依次做灭菌试管，按操作依次做10倍递增稀释倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支液，每稀释一次，换用一

5、支1 mL灭菌试管。灭菌试管。 2）乳糖发酵实验）乳糖发酵实验 接种接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种接种3个稀释度，每一稀释度接种个稀释度，每一稀释度接种3管，置管，置（36土土1)温箱内培养（温箱内培养（24士士2) h。如所有乳如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3）分离培养分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（琼脂平板上，置（36士士1)恒温箱内培养恒温箱内培养18一一24

6、 h。取出，观察菌落形态，并做革兰取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。氏染色和证实试验。4）证实试验证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（管，置（36士士1)恒温箱内培养（恒温箱内培养（24士士2) h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。肠菌群阳性。实验报告实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表

7、，报告每检索表，报告每100mL（或或g）大肠大肠菌群的菌群的MPN。革兰氏染色革兰氏染色 基本原理：基本原理： 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。步骤：结果: 阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色结晶紫初染碘液媒染乙醇

8、脱色蕃红复染涂片固定革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram Stain）革兰氏染色革兰氏染色法操作步骤法操作步骤1、涂片涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。2、染色染色：用草酸铵结晶紫染色：用草酸铵结晶紫染色1min , ,用水冲洗。用水冲洗。3、媒染媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖盖1min，用水冲去碘液。用水冲去碘液。4、乙醇脱色乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约止（约0.5min）

9、。）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。5、复染复染：蕃红染液复染：蕃红染液复染1min ,水洗。水洗。6、吸干并镜检吸干并镜检：若研究工作中要确证未知：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。行染色作对照。 细菌经细菌经结晶紫结晶紫初染染成初染染成紫色紫色。 革兰氏染色阳性菌革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色紫色。 革兰氏染色阴性菌革兰氏染色阴性菌