报告题目东海大学化学工程与材料工程学系.doc

1、題目：培養條件對毛黴mucor rouxii.生產多元不飽和脂肪酸之影響研究生：沈鳳堯 指導教授：楊芳鏘 摘要本研究探討不同培養環境對mucor rouxii bcrc 30546多元不飽和脂肪酸生成之影響。主要考量因素包括：培養時間、溫度、溶氧量、培養基組成、油類的添加、剪切力及外接式均質機（polytrron）等。結果顯示：在三角瓶中，最佳培養條件為：碳源30 g/l、氮源5 g/l、ph 5.5、溫度30，其菌體濃度（5.608 g/l）、gla濃度（0.086 g/l）、細胞油脂含量（21.6）與總油脂（1.323 g/l）。培養基中碳氮比的高低、添加的葵花油濃度及在不同的溶氧程度操作

2、條件下，皆會造成菌體生長及代謝的明顯差異。在5 l發酵槽中，轉速500 rpm、通氣量1 vvm操作下，兩階段控溫造成菌體濃度減少，使得gla濃度下降，但在菌體生產gla的能力上卻能提高42，推測可能在低溫時，菌體為了要適應其環境，而增加pufas之生成。而在饋料批式操作下則提高12.5細胞油脂含量，並且維持菌體濃度在8 g/l左右，且油脂穩定累積。將兩階段控溫與饋料批式同時進行，發現不但可以有效增加菌體生產gla的能力，提高了67，並且最大gla濃度則從0.285 g/l增加到了0.443 g/l ，約有55的提昇。此外，將轉速由500 rpm降低至300 rpm，利用兩階段控溫與饋料批式操

3、作再加上外接式均質機，則可以在低轉速下，有效阻止菌絲體的聚集，最大菌體濃度由原本的7.65 g/l增加至9.11 g/l，增加了19，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。一、 緒論1-1 前言多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, pufas)，對於人體生理功能有很大的益處，例如：-次亞麻油酸（-linolenic acid，gla）是人體母乳中所含的多元不飽和脂肪酸，具有緩和過敏性皮膚炎、改善生理痛、緩和痛風等功效，是嬰兒攝取多元不飽和脂肪酸的主要來源，一般如要取得大量油脂的方法大多由植物或動物組織所萃取。一般植物油，如紅花油、葵花油、大豆

4、油.等含有豐富的-6系脂肪酸；動物油方面，一般家禽、家畜所含的油脂多為飽和脂肪酸，長期食用容易發生心血管疾病。深海魚類之魚油及脂質中，則含有豐富的-3系多元不飽和脂肪酸，不會使血液中之膽固醇及三酸甘油脂增加，不易使血管阻塞，並且還有抗血栓之形成及降低三酸甘油脂的作用，可以預防與治療人類心血管與免疫系統方面之疾病。 -6系多元不飽和脂肪酸之gla為例，傳統來源為月見種子萃取油，琉璃苣種子萃取油以及黑醋栗種子萃取油。這些富含gla的植物籽油，在美國大約有一年2000噸、每公斤市價100美金之市場1。二、文獻回顧2-1多元不飽和脂肪酸簡介 脂質主要是由脂肪酸（fatty acids）與甘油（glyc

5、erol）所組成，其中脂肪酸是存在於生物體內之生物生合成物質。脂肪酸為325 碳原子以單鍵或雙鍵相連而成的碳氫化合物，由碳、氫、氧三元素所組成，一端為甲基(-ch3)，另一端為羧基(-cooh)，原子之間以共價鍵串聯，中間的碳原子上都連接有兩個氫原子。天然脂肪酸為偶數碳，依其碳鏈是否含有雙鍵，可區分成飽和脂肪酸、元不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸的雙鍵大多以順式（cis-configuration）存在。含有兩個以上雙鍵之不飽和脂肪酸稱為多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, pufas)，其命名方式可簡寫成cx：ynz，x代表碳源子的多寡、y為雙鍵數，nz則是甲基

6、端算起的第一個雙鍵位置1。以-次亞麻油酸為例，c18：3n6，即有18個碳、三個雙鍵，由結構得知雙鍵位置是從甲基端算起第六、第九及第十二個碳上。（圖1）為脂肪酸之分類。2-2多元不飽和脂肪酸之微生物來源 傳統上大量的多元不飽和脂肪酸之取得方法多由動物組織或植物之果實種子所萃取。植物部分如紅花油、葵花油、大豆油、玉米油以及上述的月見草籽油、琉璃苣子油等。動物方面如深海魚類之魚油以及脂質中，則含有豐富的-3系多元不飽和脂肪酸，如epa與dha。但這只是因為累積食物鏈中微生物的油脂於體內（海洋微藻->浮游生物->魚類），魚類本身並沒有合成多元不飽和脂肪酸之能力1。所以微藻類、細菌、黴菌和

7、真菌等微生物，才是合成多元不飽和脂肪酸的主要來源。2-3多元不飽和脂肪酸之合成途徑 微生物體內鏈增長與所有生物體脂肪酸增長路徑相同，以乙醯輔酶a或乙醯磷脂質(acyl-phopspholipid)為起始，然後經去飽和脂肪酵素作用，分成-3、-6、-9三系列之脂肪酸生成路徑，因此原核細胞以及某些細菌的多元不飽和脂肪酸生合成之有氧路徑，是由飽和脂肪酸經9去飽和酵素作用為起始，由此可之微生物是以油酸(c18：1 cis 9)為起始，於12去飽和成亞麻油酸(c18：2)，在以15去飽和生成-次亞麻油酸( c18：3)，此三種脂肪酸即為-9、-6以及-3系列脂肪酸的先驅物質，而多元不飽和脂肪酸的生合成分

8、別是從此三種先驅物之6位置去飽和及延長，再一次於5位置去飽和及增長，分別產生c20和c22的多元不飽和脂肪酸如（圖2）。 2-4影響油脂性真菌產油量之因素 環境因素影響包括了物理（溫度、機械剪切力、ph），或化學因子（培養基組成）。（1）培養時間：隨著培養時期的進行，油脂性微生物合成脂質可分為兩階段：第一階段，細胞生長期（growth phase），此時營養充分，微生物的菌體量與油脂同時增加中；第兩階段為脂肪合成期（production phase），若碳源仍充足但其他養分耗盡，脂肪酸持續累積於菌體內；若碳源與其他養分皆耗盡時，某些微生物會自行分解內脂質作為碳源來使用2。（2）培養基組成影響微

9、生物生長最重要的因素莫過於培養基的組成，特別是基質組成裡比重很大的碳源與氮源，其影響微生物生理狀態的程度更加直接。碳源與氮源是微生物合成細胞時所需要的成分，但在碳源足夠而氮源欠缺的情況下，微生物不在增殖，而是將所吸收的碳源轉變成脂質。(3）ph 培養基的酸鹼度往往直接了培養基裡養分的溶解度以及對微生物的質傳，甚至影響與生長有關的酵素反應。在菌相型態上，在不同的ph値培養下會有不同的菌體型態，是由於ph値影響了真菌細胞壁對機械應力的抵抗力。（4）溫度許多研究皆發現在低溫時，微生物具有較高的之-3系列不飽和脂肪酸之生產能力。推測是在低溫環境下，微生物為了要適應低溫，而增加多元不飽和脂肪酸之生成。文

10、獻指出在低溫時有較多氧溶於培養基中，而氧氣是脂肪酸進行去飽和酵素作用時所必需，故可能是溫度的不同造成溶氧不同而影響菌體生長以及代謝。（5）震盪速率震盪培養提供了菌體與養分與較佳氧氣的質傳效果。當震盪速率過慢時，除了菌體與培養基間的接觸變的不均勻之外，液面與空氣接觸的面積變小，而造成溶氧不足導致去飽和與鏈延長酵素作用能力下降；過快，所生的剪應力（shear stress）對菌體生長的有一定的傷害。（6）油類與酒精的添加 油類的添加不但可以增加油脂的累積並且可以從碳鏈的長度以及添加油脂結構的改變知道累積的油脂組成.有文獻指出在培養基中，細胞外的油脂會造成絲狀真菌在生合成脂肪酸時，油脂會在液面或菌體

11、表面形成油膜，改變培養基質、氧傳效果以及菌體間營養物質傳遞，間接改變菌體吸收以及代謝能力，而使得去飽和以及延長作用受到抑制，但是由於加入的油脂中會含特定的脂肪酸，因此可以扮演基質或前驅物來合成新的脂肪酸，可由此達到可以有商業價值的脂肪酸進行生產3。三、實驗材料與分析方法3-1 菌株本研究菌株來源為新竹食品工業發展研究所之生物資源保存暨研究中心的mucor rouxii bcrc no.30546。前培養之液態培養基組成以lindberg(1991)4最佳化之培養基質組成作為前培養基質。主培養之液態培養基組成本研究以(2005,宋)5中的培養基組成作為主培養基。3-2實驗分析方法菌體濃度菌體分析

12、方法如下：（1） 當菌體培養至收成時間，取100 ml菌液並抽氣過濾之。（2） 沖洗過濾菌體若干次再濾乾。（3） 將菌體從濾紙刮下並放置於玻璃取樣瓶中，隨後於-20下冰凍之。（4） 於取樣瓶口中用鋁箔紙密封並戳數洞，於-110、100 mmhg下冷凍乾燥24 hr。（5） 取出冷凍乾燥之菌體秤重紀錄之，並經由換算可得菌體濃度。脂質萃取與水解 稱取0.1克之菌體重，使用均質機以15000 rpm打碎2分鐘，再加入8 ml之15（w/v）氫氧化鉀酒精溶液置於一密封玻璃瓶中於70水浴中水解2小時後，利用濃鹽酸將ph調至3以下，再用正己烷8 ml連續萃取兩次，每一次均震盪1分鐘，合併後取出正己烷層，置

13、於70烘箱中24小時，測油脂重。 脂肪酸甲酯之製備樣品處理步驟如下：（1）細胞破碎：秤取0.1克之細胞乾重並加入koh / meoh溶液、以細胞破碎機破碎細胞，儘可能的不要有糾結成團的菌體存在，以免造成實驗上分析誤差。（2）皂化：將以破碎的koh / meoh菌液，於60密閉狀態下水浴30分鐘進行皂化反應。本反應為鹼催化製程，生成脂肪酸鉀。（3）甲酯化：將前述皂化後的產物冷卻至室溫，加入hcl / meoh以及bf3 / meoh 作為催化劑。於60水浴30分鐘形成脂肪酸甲酯，反應冷卻後加入飽和nacl 溶液均勻混合，以避免乳化。再添加正己烷（n-hexane）以萃取脂肪酸甲酯再以gc分析。第

14、四章 、實驗結果與討論4-1三角瓶實驗培養時間之影響 如圖3所示，在4天以前為生長期，其菌體濃度與油脂隨時間進行而累積，到第四天時其碳源已經消耗完了，而此時的菌體濃度（5.608 ± 0.244 g/l）、gla濃度（0.086 ± 0.0025 g/l）、細胞油脂含量（21.6 ± 2.35）與總油脂（1.323 ± 0.111 g/l）則到達到最高點，第四天後，推測由於沒有碳源可以提供微生物生長以及代謝，菌體便會自我分解細胞體內儲存的油脂來當作碳源使用，而菌體的自我分解導致細胞油脂含量、gla濃度與總油脂的減少。碳氮比之影響 由圖4可以發現，當我們將

15、菌體培養至一定濃度時，再置入於新的培養基中，而當新的培養基中沒有任何氮源時，其細胞油脂含量為最高，但是因為缺乏氮源，使得菌體無法再次生長，因此菌體濃度為最低，也造成總油脂無法再往上提升；當在有添加氮源時，無論氮源濃度的多寡，其細胞油脂含量，皆低於不加氮源的條件。 添加sunflower oil之影響由圖5所示，當添加10 g/l的葵花油時達到最大值，gla濃度從沒有添加時的0.086 g/l提升到0.095 g/l，提高了將近10，但是無論添加多少濃度的油類，對菌體的生成以及油脂的累積則有不利的影響，推測由於添加油類會在液面或菌體表面形成油膜，改變培養基質、造成氧傳效果變差以及菌體間營養物質傳

16、遞困難，改變了菌體吸收以及代謝能力。並且因為亞麻油酸是次亞麻油酸的前驅物，因此有刺激次亞麻油酸（gla）的生成效果，但是當濃度過高則不利於gla之生產。4-2 5 l發酵槽兩階段控溫 由圖6可知，第48小時將溫度降低至20後，明顯的發現菌體濃度開始減少，造成gla濃度、總油脂的下降，值得注意的是，當將溫度從30降到20時，do值也從100降到80左右，推測可能是微生物為要適應低溫的環境下，在生產大量多元不飽合脂肪酸的同時，對氧的需求量增加了。饋料批式 由圖7可知，第48小時加入320 g/l 的葡萄糖250 ml 觀察發現，其菌體濃度均維持在8 g/l左右，雖然此時菌體已不再繼續生長，但是加入

17、的碳源則可以有效的抑制菌體自我分解的情況發生，也因為如此，使得總油脂也穩定維持在4 g/l上下，而do溶氧的下降在此實驗中並沒有發生。兩階段控溫並搭配饋料批式 有鑒於兩階段控溫以及饋料批式之實驗，發現在培養過程中降低溫度，可以增加菌體生產多元不飽和脂肪酸的能力，但是此時的菌體濃度會因此而減少，導致gla濃度與總油脂的減少；而在培養過程中加入碳源，則可以減少細胞因為碳源的不足，而發生自我分解的現象，因此將兩者同時操作將可能有利於脂肪酸合成以及油脂累積。 如圖8發現在48小時將溫度改變以及添加碳源之後，其菌體濃度依然會呈現減少的趨勢，有別於單純只是改變溫度時之條件，此時菌體減少的速率較慢，這說明了

18、溫度對於菌體濃度的影響大於碳源的影響。polytron 間歇式均質 如圖9所示，雖然有外接polytron，但在48小時後，降溫所產生的影響以及饋料批式的效果一樣存在，且在轉速300 rpm時，利用polytron間歇式均質，就不會有菌體聚集的情形發生，且最大菌體濃度達到9.11 g/l。 將不同的操作方式做一個比較如表1，當我們在培養過程採用兩階段控溫，發現菌體生產gla的能力增加了，對於恆溫以及饋料批式條件下分別增加了42與47，說明了溫度對產gla的影響；而對於油脂的累積，發現添加的碳源的確是可以增加細胞的油脂含量，對於恆溫以及兩階段控溫條件下則分別增加了12.5以及17，說明碳源影響到

19、細胞油脂的累積；而將兩階段控溫搭配饋料批式之方法則可以將gla濃度提升，從恆溫條件下的0.285 g/l到0.443 g/l提高了將近55，且又不會造成油脂累積的減少；而在300 rpm轉速下，外接polytron間歇式均質，可以使最大菌體濃度由原本的7.65 g/l增加至9.11 g/l，增加了19，且在脂肪酸生合成以及油脂累積方面，也有明顯的提升效果。第五章、結論以及未來展望5-1 結論mucor rouxii生產多元不飽和脂肪酸時，需要氧分子進行去飽和作用，因此培養中如何讓菌體有充足的溶氧，是影響多元不飽和脂肪酸濃度高低以及組成的重要關鍵。在三角瓶實驗中，發現：適當的碳源與限制的氮源濃度

20、，是菌體生長以及油脂累積的關鍵，除此之外，發現溫度、碳氮比、震盪速率以及培養體積，亦會影響菌體濃度，還會造成培養液裡溶氧程度的不同，而影響菌體在合成多元不飽和脂肪酸時的能力，而添加油類則可以有效的促進gla的生成。當培養系統中如果有溶氧不足、碳源缺乏或者碳源濃度過高等情形時，菌絲的尾端就會有大量的分節孢子出現，當有這種現象發生時，皆不利於菌體生長、脂肪酸生合成以及油脂的累積。 5 l發酵槽實驗中，發現通氣量的大小、溶氧值差異以及轉速高低不同，影響菌體濃度、不飽和脂肪酸、油脂累積的情形更明顯；兩階段控溫雖然會提高菌體生產gla的能力但卻不利於菌體濃度；饋料批式則可以有效的抑制菌體的自我分解情況發

21、生；而將兩者結合，則發現菌體濃度依然會受到溫度的影響，但添加的碳源則可減緩菌體濃度下降的速度，而細胞油脂含量並沒有如預期的增加，但菌體生產gla的能力則明顯增加，而且gla濃度則從0.285 g/l增加到了0.443 g/l；外接式的polytron的確可以有效的降低菌體的聚集，對於脂肪酸生合成以及油脂累積皆有明顯的幫助，但是polytron的效果取決於均質頻率，因為時間的長短以及轉速的高低，皆會對菌體生長及代謝造成不同程度的影響。5-2未來展望1. 以農業廢棄物為基質進行發酵培養，例如：米糠、麥麩、馬鈴薯皮等，亦可生產多元不飽和脂肪酸，利用農產廢棄物不僅可減少環境污染，也可以降低發酵成本，是

22、種符合經濟效益的生產方式。2. 均質機（polytron）在發酵槽的應用上， 其均質的頻率對於菌體形態、生長以及代謝有很大的關聯，因此找出最佳的均質條件，將是可以未來可以再進一步探討的方向。參考文獻1 alonso, d.l., maroto, f.g.,（2000）.,plant as chemical factories for the production of polyunsaturated fatty acids, biotechnology advances 18：481-497.2 kavadia, a., komaitis, m., chevalot, i., blanchar

23、d, f., mark, i. and aggelis, g.,（2001）.,lipid and -linolenic acid accumulation in strain of zygomycetes growing in glucose, journal of the american oil chemists' society .78（4）：341-346.3 certik, m., balteszova, l. and sajbidor, j.（1997）., lipid formation and -linolenic acid production by mucorales fungi grown on sunflower oil. letters in applied microbiology.25：101-105.4 lindberg, a. m., hansson, l., （1991）.,production of -linolenic acid by the f