NK细胞杀伤活性检测兼学习教案

1、会计学1NK细胞细胞(xbo)杀伤活性检测兼杀伤活性检测兼第一页，共29页。第1页/共29页第二页，共29页。第2页/共29页第三页，共29页。实验实验(shyn)原理原理 效应效应(xioyng)细胞细胞 靶细胞靶细胞 释放释放LDH 丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸(r sun)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT吩嗪二甲酯硫酸盐吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝硝基氯化四氮唑蓝第3页/共29页第四页，共29页。第4页/共29页第五页，共29页。第5页/共29页第六页，共29页。实验实验(shyn)步骤步骤效应细胞效应细胞(xbo)的制备（分离外周血单个的制备（分离外周血单个

2、核细胞核细胞(xbo)）靶细胞的制备靶细胞的制备(zhbi)效效-靶细胞相互作用靶细胞相互作用酶促反应酶促反应结果判读结果判读第6页/共29页第七页，共29页。 取培养取培养2448hr的靶细胞的靶细胞(K562), 洗涤洗涤3次（次（1000rpm10min）, 最后最后(zuhu)用完全用完全RPMI-1640培养液调整培养液调整细胞浓度至细胞浓度至1105/ml, 备用。备用。靶细胞的制备靶细胞的制备(zhbi)：第7页/共29页第八页，共29页。效应效应(xioyng)细胞的制备细胞的制备（分离外周血单个核细胞）（分离外周血单个核细胞）采集采集(cij)静脉血静脉血4 ml，加，加0.

3、2ml肝素溶液（肝素溶液（125-250U/ml）抗凝）抗凝分别吸取分别吸取(xq)2ml淋巴细胞分层液置淋巴细胞分层液置10ml离心管中，离心管中，将管倾斜将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血，沿管壁缓缓注入抗凝血离心离心2000rpm20min第8页/共29页第九页，共29页。密度梯度离心分离淋巴细胞亚群密度梯度离心分离淋巴细胞亚群第9页/共29页第十页，共29页。用完全用完全RPMI-1640定容细胞，计数定容细胞，计数(j sh)后调整细胞浓度后调整细胞浓度（加入（加入0.2ml完全完全RPMI-1640 ，混匀，混匀，1x 107）将所得将所得PBMC用用5倍体积倍体积(tj)的的16

4、40洗涤一次洗涤一次2000rpm10 min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）第10页/共29页第十一页，共29页。第11页/共29页第十二页，共29页。第12页/共29页第十三页，共29页。第13页/共29页第十四页，共29页。效效 - 靶 细 胞 作 用靶 细 胞 作 用(zuyng) 将效应将效应(xioyng)细胞和靶细胞各细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入加入96孔细胞培养板的孔中孔细胞培养板的孔中, 每份标本设每

5、份标本设2个复孔个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml RPMI-1640液液)最大释放对照组最大释放对照组 (0.1ml靶细胞靶细胞+0.1ml1NP-40液液), 1000r/min, 2min后后, 置置37、5CO2温箱中孵育温箱中孵育2-4h。第14页/共29页第十五页，共29页。A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 实验组实验组 自然释放组自然释放组 最大释放组最大释放组 1 2 3 4 5 6 效应细胞（效应细胞（100l） + + - - - -靶细胞（靶细胞（100l） + + + + + +RP

6、MI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 第15页/共29页第十六页，共29页。第16页/共29页第十七页，共29页。酶促反应酶促反应(fnyng)置置37预温预温10min, 加入新鲜配制的底物加入新鲜配制的底物(d w)溶液溶液0.1ml, 37避光反应避光反应1015min。终止酶促反应终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸柠檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12第17页/共29页第十八页，共29页。结果结果(ji gu)计计算算 用酶标检测仪在用酶标检测仪在570n

7、m波长波长(bchng)下读下读取各孔取各孔OD值值, 并计算并计算NK细胞活性。细胞活性。实验组实验组OD值值-自然自然(zrn)释放对照组释放对照组OD值值NK细胞活性（细胞活性（%）最大释放对照组最大释放对照组OD值值-自然释放对照组自然释放对照组OD值值=100%第18页/共29页第十九页，共29页。1、无论采用何种试验方法、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放胞标记率、自然释放(shfng)率及实验稳定性率及实验稳定性的重要因的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放素。一般要求靶细胞的自然释放(shfng)率率10。2、分离、分离PBMC

8、时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细应尽可能不吸动沉淀的细 胞。胞。4、用此法测得、用此法测得NK活性的正常值范围在活性的正常值范围在10-40%。注意事项注意事项:第19页/共29页第二十页，共29页。1.1. 记录记录NKNK细胞细胞(xbo)(xbo)杀伤实验的原理、杀伤实验的原理、方法、方法、2.2. 结果。结果。第20页/共29页第二十一页，共29页。第21页/共29页第二十二页，共29页。E E花环形成试验花环形成试验（Erythrocyte roset

9、te Erythrocyte rosette formation test, ERFTformation test, ERFT）【目的【目的(md)(md)要求】要求】1.1.掌握掌握T T淋巴细胞淋巴细胞E E花环试验花环试验的原理、正常值，的原理、正常值， 了解其方法和用途。了解其方法和用途。2.2.熟悉光镜下熟悉光镜下E E花环的形态和花环的形态和计数方法。计数方法。第22页/共29页第二十三页，共29页。【实验原理】【实验原理】 T T细胞表面具有能与绵羊红细胞（细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBCSRBC）表面糖肽结合的受体，称为表面糖肽结合的受体，称为E E受体（受体（CD2CD2

10、）。）。已证实已证实E E受体是人类受体是人类T T细胞所特有的表面标细胞所特有的表面标志。当志。当T T细胞与细胞与SRBCSRBC混合后，混合后，SRBCSRBC便粘附于便粘附于T T细胞表面，呈现细胞表面，呈现(chngxin)(chngxin)花环状。通花环状。通过花环形成检查过花环形成检查T T细胞的方法，称为细胞的方法，称为E E花环花环形成试验。形成试验。第23页/共29页第二十四页，共29页。根据花环根据花环(hu hun)(hu hun)形成的多少，可测知形成的多少，可测知T T细胞细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾

11、病的预后，考核药物疗效等。判断疾病的预后，考核药物疗效等。第24页/共29页第二十五页，共29页。第25页/共29页第二十六页，共29页。 【实验方法】【实验方法】淋巴细胞与淋巴细胞与SRBC按一定比例按一定比例(1:10)混合混合 37 5分钟，分钟， 420分钟分钟 取样取样(qyng)涂片瑞氏染色、涂片瑞氏染色、镜检。镜检。 计数计数E花环数，算出总花环形成率。花环数，算出总花环形成率。 正常值为正常值为60%80%。 第26页/共29页第二十七页，共29页。出花环形成百分率，并推测出花环形成百分率，并推测其其T T淋巴细胞淋巴细胞(xbo)(xbo)百分率。百分率。正常值为：正常值为：505080