生物质谱分析

1、生物分析技术术第第5讲讲 生物质谱分析生物质谱分析 2011年年10月月第一节第一节 概述概述第二节第二节 质谱仪质谱仪第三节第三节 生物质谱的应用生物质谱的应用主要内容主要内容 质谱分析法质谱分析法(Mass Spectroscope,MS)是将是将化合物形成离子或碎片离子，按质荷比化合物形成离子或碎片离子，按质荷比(m/z)的的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定性和定量分析，生物大分子的

2、结构分析，同位性和定量分析，生物大分子的结构分析，同位素的测定及固体表面的结构和组成分析。素的测定及固体表面的结构和组成分析。 生物质谱就是用于生物分子分析的质谱技生物质谱就是用于生物分子分析的质谱技术。由于生物分子大多数以其高相对分子质量术。由于生物分子大多数以其高相对分子质量区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小分子，因而，生物质谱要求测定上万甚至几十分子，因而，生物质谱要求测定上万甚至几十万的分子质量。万的分子质量。第一节第一节 概述概述 早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子的研究，因为要将质谱应用于生物大

3、分子需要将的研究，因为要将质谱应用于生物大分子需要将其制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解其制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解成离子。如何使蛋白分子经受住离子化过程而又成离子。如何使蛋白分子经受住离子化过程而又不丧失其结构形态是个难题。不丧失其结构形态是个难题。20世纪世纪70年代，解年代，解吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子，而后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质使得，而后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质使得具有极性、热不稳定的蛋白分子可经受住电离过具有极性、热不稳定的蛋白分子可经受住电离过程。但这些方法仅限于程。但这些方法仅限于10

4、kD以下蛋白分子的研究以下蛋白分子的研究。80年代电喷雾电离年代电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电和基质辅助激光解吸电离离(MAILDI) 技术的发展则使得质谱方法成功应技术的发展则使得质谱方法成功应用于高分子量蛋白分子的研究。用于高分子量蛋白分子的研究。 1906年年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在实验中发现带电荷离子在在 电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关 并于并于1912年制造出第一台质谱仪年制造出第一台质谱仪 1946年年 飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器 1953年年 四极杆质量分析器四极杆质量分析器 1959年年 质谱仪首次

5、用于多肽测序质谱仪首次用于多肽测序 1965年年 离子共振质谱离子共振质谱 1968年年 电喷雾离子源电喷雾离子源 1974年年 傅里叶变换离子回旋共振分析器傅里叶变换离子回旋共振分析器 1987年年 基质辅助激光解吸电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱质谱仪的发展历史质谱仪的发展历史日本科学家田中耕一日本科学家田中耕一(Koichi Tanaka)1959年出生于日本富山年出生于日本富山县首府富山市，县首府富山市，1983年获日本年获日本东北大学学士学位，现任职于东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部研发工程师，分析测量事业部生命

6、科学商务中心、生命科学生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰类似于约翰芬恩，因此也得到芬恩，因此也得到了了14的奖金。的奖金。美国科学家约翰美国科学家约翰芬恩芬恩1917年出年出生于美国纽约市，生于美国纽约市，1940年获耶鲁年获耶鲁大学化学博士学位，大学化学博士学位，1967年到年到1987年间任该大学教授，年间任该大学教授，1987年年起被聘为该大学名誉教授，自起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为授。他因为“发明了对生物大分发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法子进行确认和结构分析

7、的方法”和和“发明了对生物大分子的质谱发明了对生物大分子的质谱分析法分析法”而获得今年诺贝尔化学而获得今年诺贝尔化学奖奖14的奖金。的奖金。瑞士科学家库尔特瑞士科学家库尔特维特里希维特里希1938年生于瑞士阿尔贝格，年生于瑞士阿尔贝格，1964年获瑞士巴塞尔大学无年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，从机化学博士学位，从1980年年起担任瑞士苏黎世联邦高等起担任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学理工学校的分子生物物理学教授，还任美国加利福尼亚教授，还任美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。他因所客座教授。他因“发明了发明了利用核磁共振技术测定溶液利用核

8、磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方中生物大分子三维结构的方法法”而获得而获得2002年诺贝尔化年诺贝尔化学奖一半的奖金。学奖一半的奖金。2002年诺贝尔化学奖获得者年诺贝尔化学奖获得者第二节第二节 质谱仪质谱仪一、质谱仪的工作原理一、质谱仪的工作原理二、质谱仪的基本结构二、质谱仪的基本结构 1. 真空系统真空系统 2. 进样系统进样系统 3. 离子源离子源 4. 质量分析器质量分析器 5. 检测与记录检测与记录离子源离子源质量过滤质量过滤/分析器分析器样品板样品板LC或或GCEI源源FAB源源MALDI源源ESI源源QuadruopoleIon trapTime-of-flight电子

9、倍增器电子倍增器闪烁计数器闪烁计数器+ + + + + + + + + + + + + + + + + +一、质谱仪的工作原理一、质谱仪的工作原理样品导样品导入系统入系统检测器检测器 zU=(1/2)m 2 m/z=2U/ 2 化合物分子在高真空条件下，受高速电子流化合物分子在高真空条件下，受高速电子流“轰击轰击”或强电场其他作用，失去电子生成离子或强电场其他作用，失去电子生成离子或发生化学键断裂成为碎片离子，离子经加速器或发生化学键断裂成为碎片离子，离子经加速器进入磁场，其动能与加速电压及电荷遵循：进入磁场，其动能与加速电压及电荷遵循： 具有速度具有速度 的的带电带电离子离子进入质谱分析器的

10、进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比的不同实现分离。离子按质荷比的不同实现分离。质谱仪的分类质谱仪的分类二、质谱仪的基本结构二、质谱仪的基本结构质谱仪的构造和功能质谱仪的构造和功能计算机控制与数计算机控制与数据处理据处理1. 真空系统真空系统2. 进样系统进样系统3. 离子源离子源4. 质量分析器质量分析器5. 检测与记录检测与记录 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，一般应在高真空状态下工作，一般应在10-510-6Pa。 (1)真空度差，过多的氧气将损耗或烧

11、毁离子源真空度差，过多的氧气将损耗或烧毁离子源的灯丝；的灯丝； (2)高本低气压将干扰质谱图高本低气压将干扰质谱图; (3)电离空气压过高，会发生离子电离空气压过高，会发生离子-分子反应，改分子反应，改变碎片谱图；变碎片谱图； (4)离子源内的高气压将干扰电子束的调节；离子源内的高气压将干扰电子束的调节； (5)电离气或离子源内的高气压，可能引起高达电离气或离子源内的高气压，可能引起高达数千伏的离子加速电压放电。数千伏的离子加速电压放电。1. 真空系统真空系统 一般质谱仪由机械真空泵一般质谱仪由机械真空泵(低真空泵低真空泵)，扩散泵或，扩散泵或分子泵分子泵(高真空泵高真空泵)组成真空机组，使离

12、子源和分组成真空机组，使离子源和分析器部分的达到真空。析器部分的达到真空。 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。达接收器，真空度不够则灵敏度低。2. 进样系统进样系统要求：要求： 高效重复的将样品引入到离子源中并且不能高效重复的将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决定于样品的物理性质。定于样品的物理性质。方式：方式： (1)间歇式进样系统间歇式进样系统 (2)直接探针进样直接探针进样 (3)毛细管进样（从毛细管进样（从HPLC、GC及及CE） (

13、1)间歇式进样系统间歇式进样系统 可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液体试样引入试样储存器中。体试样引入试样储存器中。 由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透进高真空的离子源。分子流的形式渗透进高真空的离子源。(2)直接探针进样直接探针进样 通常将试样放

14、入小杯中，通过真空闭锁装置通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热处理。处理。 对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可直接引入到离子源。直接引入到离子源。 这种进样方式不必使样品充满整个储存器，这种进样方式不必使样品充满整个储存器，因此，可适用样品量较小和蒸汽压较低的物质。因此，可适用样品量较小和蒸汽压较低的物质。直接进样法扩大了质谱法的应用范围。直接进样法扩大了质谱法的应用范围。(3)毛细管

15、进样毛细管进样气相色谱气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪 从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引入质谱仪的离子化室。入质谱仪的离子化室。液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪 采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样品离子进入质谱分析仪。品离子进入质谱分析仪。 质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。 不同的分子离子化所需要的能量不同，因此，不同的分子离子化所需要的能量不同，因此，应选择不同的离解方式：应选

16、择不同的离解方式： 硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。 软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易 破裂或易电离的样品。破裂或易电离的样品。3. 离子源离子源(1)电子轰击电离源电子轰击电离源 (Electron Impact Ionization, 简称简称 EI):样品需经过汽化进入电离区，用约样品需经过汽化进入电离区，用约70eV能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离，为硬电离方法。，为硬

17、电离方法。1980年以年以 前的主要离子化方式，前的主要离子化方式， 只能用于有机小分子只能用于有机小分子 (400Da以下以下)的电离。的电离。 质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源电子轰击电离电子轰击电离的优缺点的优缺点 优点优点 灵敏度高；灵敏度高； 有达有达10万个化合物的数万个化合物的数据库可快速检索；据库可快速检索； 可根据碎片方式鉴定未可根据碎片方式鉴定未知物；知物；从碎片离子判定结构。从碎片离子判定结构。 缺点缺点 质量范围小；质量范围小； 有可能汽化前发生解有可能汽化前发生解离；离；碎片过多有时看不到碎片过多有时看不到分子离子。分子离子。质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源(

18、2)化学电离源化学电离源 (Chemical Ionization, 简称简称 CI):高高能电子束与小分子反应气（如甲烷、丙烷等）能电子束与小分子反应气（如甲烷、丙烷等）作用，使其电离生成初级离子，这些初级离作用，使其电离生成初级离子，这些初级离子在与试样分子反应得到试样离子，核心是子在与试样分子反应得到试样离子，核心是质子转移。质子转移。 (3)场电离场电离 (Field Ionization, 简称简称 FI):在相距很近在相距很近的电极间施加高电压，产生强电场，依靠这的电极间施加高电压，产生强电场，依靠这个强电场将附近的试样分子中的电子拉出来，个强电场将附近的试样分子中的电子拉出来，使

19、之形成离子。使之形成离子。质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源(4) 快原子轰击源快原子轰击源(Fast Atom Bombardment，简，简称称FAB):20世纪世纪80年代发展起来的新离子化方年代发展起来的新离子化方法，是让稀有气体（氙气或氩气）电离，通法，是让稀有气体（氙气或氩气）电离，通过电场加速，获得较高动能成为快原子，然过电场加速，获得较高动能成为快原子，然后轰击试样分子，后轰击试样分子， 通过能量的转移，通过能量的转移， 使试样分子电离。使试样分子电离。 快原子轰击技术优点：快原子轰击技术优点： 分子离子和准分子离子峰强；分子离子和准分子离子峰强； 碎片离子峰丰富；碎片离子峰

20、丰富；灵敏度高，适用于热不稳定、极性强的分子，灵敏度高，适用于热不稳定、极性强的分子，如肽类、蛋白质、多糖、金属有机物等。如肽类、蛋白质、多糖、金属有机物等。快原子轰击技术缺点：快原子轰击技术缺点：试样涂在金属板上，溶剂也被电离，使质谱图复试样涂在金属板上，溶剂也被电离，使质谱图复杂化。杂化。质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源(5)大气压化学电离源大气压化学电离源 (Atmospheric Pressure Chemical Ionization，简称，简称APCI):主要用于液相主要用于液相色谱色谱-质谱联用仪，主要用来分析中等极性、质谱联用仪，主要用来分析中等极性、弱极性化合物。弱极性化

21、合物。APCI主要产生单电荷离子，主要产生单电荷离子，分析化合物的相对分子质量一般小于分析化合物的相对分子质量一般小于1000. APCI主要部件是一个双层套管组成的电喷雾的喷嘴，主要部件是一个双层套管组成的电喷雾的喷嘴，喷嘴内层是液相色谱流出物，外层是雾化气，通常为大流喷嘴内层是液相色谱流出物，外层是雾化气，通常为大流量的量的N2，其作用是使喷出的液体分散成微滴。在喷嘴的下，其作用是使喷出的液体分散成微滴。在喷嘴的下游有一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空游有一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生气中某些中性分子电离，产生H3O+, N2+, O2

22、+等离子，这些等离子，这些离子与分析物分子进行离子离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子分子反应，使分析物分子离子化。化。(6)电喷雾电离电喷雾电离 (Electrospray Ionization，简称，简称ESI):是一种使用强静电场的电离技术。它主要应是一种使用强静电场的电离技术。它主要应用于液相色谱用于液相色谱-质谱联用仪或毛细管电泳质谱联用仪或毛细管电泳-质谱质谱联用仪，既作为色谱和质谱之间的接口装置，联用仪，既作为色谱和质谱之间的接口装置，同时又是电离装置。同时又是电离装置。质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源 电喷雾电离是在电喷雾电离是在“离子蒸发离子蒸发”的原理基

23、础的原理基础上发展起来的一种离子化方法。待测分子溶解在上发展起来的一种离子化方法。待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中口高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随微的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随微滴半径的减少而增加，到达某一临界点时，样品滴半径的减少而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，即实将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，即实现了样品的离子化，由于没有直接的外界能量作现了样品的离子化，由于没有直接的外界能量作

24、用于分子，因此，对分子结构破坏较少，是一种用于分子，因此，对分子结构破坏较少，是一种典型的软电离方式。典型的软电离方式。 电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子，电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子，因此，在较小的因此，在较小的m/z范围内可以检测到大分子质范围内可以检测到大分子质量的分子。电喷雾质谱目前可测定分子质量在量的分子。电喷雾质谱目前可测定分子质量在100.000Da以下的蛋白质，最高达以下的蛋白质，最高达150.000Da。适宜。适宜相对分子质量大、稳定性差的化合物，如极性强相对分子质量大、稳定性差的化合物，如极性强的大分子有机化合物，蛋白质、肽、糖等。除分的大分子有机化合物，蛋

25、白质、肽、糖等。除分析大分子外，电喷雾质谱也可分析小分子，对于析大分子外，电喷雾质谱也可分析小分子，对于分子量在分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物质的以下的小分子，也可得到物质的分子质量。分子质量。影响电喷雾电离的因素：影响电喷雾电离的因素： 样品的样品的pKa和溶液的和溶液的pH 样品离子取决于样品在喷雾溶液中是否形样品离子取决于样品在喷雾溶液中是否形成离子，正离子检测中，溶液成离子，正离子检测中，溶液pH应较低，负离应较低，负离子检测，溶液子检测，溶液pH应较高。应较高。 溶剂的性质溶剂的性质 用于电喷雾电离的溶剂应能使样品在溶液用于电喷雾电离的溶剂应能使样品在溶液中形成离子，既

26、有较低的溶剂化能力以利于离中形成离子，既有较低的溶剂化能力以利于离子蒸发，具有较低的黏度和表面张力以利于雾子蒸发，具有较低的黏度和表面张力以利于雾化以及具有较低热容量以利于溶剂化。化以及具有较低热容量以利于溶剂化。电喷雾电离优缺点电喷雾电离优缺点优点优点 测定分子质量高；测定分子质量高； 灵敏度极高（灵敏度极高（10-15mol）；）； 软电离，可观察生物分子非共价反应；软电离，可观察生物分子非共价反应； 易于和易于和LC串联，直接分析流速为串联，直接分析流速为1ml/min的的LC洗脱液；洗脱液； 没有基质干扰；没有基质干扰； 适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析适于四极杆质量分

27、析器、离子阱质量分析器做结构分析； 带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子，通过计算平均值给出更精确的质量数；，通过计算平均值给出更精确的质量数； 特别适于测多肽的修饰；特别适于测多肽的修饰；样品前处理简单可直接分析样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。脱盐处理的溶液。电喷雾电离优缺点电喷雾电离优缺点缺点缺点 耐盐能力低；耐盐能力低； 对某些化合物特别敏感，污染难清洗；对某些化合物特别敏感，污染难清洗； 样品需先气化；样品需先气化； 带多电荷，在分析混合物时，产生混乱；带多电荷，在分析混合物时，产生混乱；定量时需内校准。

28、定量时需内校准。电喷雾与大气压化学电离的比较电喷雾与大气压化学电离的比较 电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电离是高压放电发生了质子转移而生成电发生了质子转移而生成MH+或或M-H-离子。离子。 样品流速：样品流速：APCI源可从源可从0.2到到2 mlmin；而电喷雾源允；而电喷雾源允许流量相对较小许流量相对较小,一般为一般为0.2-1 mlmin. 断裂程度；断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解物就足以使其分解. 适用性：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和适用性：通常认

29、为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于更适合于分析极性较小的化合物。分析极性较小的化合物。 多电荷：多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子源不能生成一系列多电荷离子(7)基质辅助激光解吸离子化基质辅助激光解吸离子化 (Matrix Assisted Laser Desorption，简称，简称MALDI):是近是近20年发展起来的年发展起来的离子化技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷离子化技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子的离子化。通常用飞行时间检测酸等生物大分子的离子化。通常用飞行时间检测

30、器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸/电离电离飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多态性的分析等。态性的分析等。 质谱技术中的离子源质谱技术中的离子源基质辅助激光解吸电离工作原理基质辅助激光解吸电离工作原理 基质辅助激光解吸离子化基质辅助激光解吸离子化引入了固体基质，使样品液与引入了固体基质，使样品液与基质液混合，滴于靶面，在真基质液混合，滴于

31、靶面，在真空中快速干燥，制成极细的混空中快速干燥，制成极细的混晶。当激光束照射在涂有样品晶。当激光束照射在涂有样品和基质混晶的靶面上时，基质和基质混晶的靶面上时，基质的有机分子在固态混晶中共振的有机分子在固态混晶中共振吸收能量，并将能量传递到基吸收能量，并将能量传递到基质有机物晶体的晶格中，使晶质有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时强烈扰动而解吸出格受到瞬时强烈扰动而解吸出离子或中性分子，并通过这些离子或中性分子，并通过这些离子或分子将吸收的能量传递离子或分子将吸收的能量传递给生物大分子而使其电离。给生物大分子而使其电离。基质辅助激光解吸离子化原理基质辅助激光解吸离子化原理基质辅助激光解吸离子化

32、特点基质辅助激光解吸离子化特点 基质辅助激光解吸离子化中，激光的能量基质辅助激光解吸离子化中，激光的能量大量消耗于晶格扰动中，并不是直接作用与生物大量消耗于晶格扰动中，并不是直接作用与生物大分子使之裂解，因此是一种非常温和的离子化大分子使之裂解，因此是一种非常温和的离子化方式；方式； 激光采用激光采用N2激光源，波长为激光源，波长为337nm，为脉，为脉冲式工作方式；冲式工作方式； 基质辅助激光解吸电离源与飞行时间质量基质辅助激光解吸电离源与飞行时间质量分析仪所构成的质谱仪，得到的质谱信息主要是分析仪所构成的质谱仪，得到的质谱信息主要是分子离子、准分子离子，而碎片离子和多电荷离分子离子、准分子

33、离子，而碎片离子和多电荷离子较少。子较少。 基质辅助激光解吸电离源的关键是使用基基质辅助激光解吸电离源的关键是使用基质来实现软电离，基质的具体作用：质来实现软电离，基质的具体作用：从激光束吸收激光能量并转变为凝聚相的激发从激光束吸收激光能量并转变为凝聚相的激发能；能；基质包围样品分子，使之相互隔离，限制聚集基质包围样品分子，使之相互隔离，限制聚集体的形成，避免聚集体大分子对解吸和分析的体的形成，避免聚集体大分子对解吸和分析的影响；影响；促进样品分子的离子化过程。促进样品分子的离子化过程。 基质辅助激光解吸电离源的基质种类很多，基质辅助激光解吸电离源的基质种类很多，对于不同的分析对象应选择不同的

34、基质，否则对于不同的分析对象应选择不同的基质，否则对分析结果影响很大。对分析结果影响很大。基质必须满足一些共性：基质必须满足一些共性：在合适溶剂中具有良好的溶解性；在合适溶剂中具有良好的溶解性；对激光具有良好的吸收性能，以使能量在基对激光具有良好的吸收性能，以使能量在基 质中积累；质中积累；合适的反应活性。合适的反应活性。常用基质常用基质基质基质缩写缩写适用范围适用范围-氰基氰基-4-羟基肉桂酸羟基肉桂酸HCCA生物高分子、糖蛋白、肽类、有机生物高分子、糖蛋白、肽类、有机化合物、聚合物等化合物、聚合物等3,5-二甲氧基二甲氧基-4-羟基肉桂酸羟基肉桂酸SA蛋白质、肽类、氨基酸蛋白质、肽类、氨基

35、酸2,5-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸DHB2001000Da的有机化合物、氨基的有机化合物、氨基酸、肽类及糖蛋白酸、肽类及糖蛋白3-羟基吡啶甲酸羟基吡啶甲酸HPA约约10 000Da的聚合物、肽类、寡核的聚合物、肽类、寡核苷酸、糖蛋白、糖肽及水溶性聚合苷酸、糖蛋白、糖肽及水溶性聚合物物2,4,6-三羟基苯乙酮三羟基苯乙酮THAP蛋白质、肽类、氨基酸蛋白质、肽类、氨基酸2, 6-二羟基苯乙酮二羟基苯乙酮DHAP糖蛋白、糖肽、磷酸化肽糖蛋白、糖肽、磷酸化肽基质辅助激光电离源的优缺点基质辅助激光电离源的优缺点优点优点质量数可达质量数可达300,000Da；10-15 至至10-18级灵敏度；级灵敏度；

36、软电离方式，无或极少软电离方式，无或极少碎片离子；碎片离子；耐盐（样品含盐可达毫耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）；摩尔浓度）；适于分析复杂混合物。适于分析复杂混合物。缺点缺点分辨率低；分辨率低；1000Da以下基质峰干扰；以下基质峰干扰；激光解吸附离子化有可能使样激光解吸附离子化有可能使样品光降解；品光降解；不能分析非共价键相互作用；不能分析非共价键相互作用；定量时需要内校准；定量时需要内校准；如没有反射飞行装置，不能分如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。析多肽修饰。4. 质量分析器质量分析器 质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，依据不同的方式将样品

37、离子按质荷比分开。间，依据不同的方式将样品离子按质荷比分开。离子通过分析器后，按不同质荷比离子通过分析器后，按不同质荷比(m/z)分开，将分开，将相同的相同的m/z离子聚焦在一起。离子聚焦在一起。 质量分析器的类型：质量分析器的类型：(1)磁分析器磁分析器(2)四极杆分析器四极杆分析器(3)离子阱离子阱(4)飞行时间分析器飞行时间分析器(5)傅立叶变换离子回旋共振分析器傅立叶变换离子回旋共振分析器(1)磁分析器磁分析器 磁分析器依据不同质量的离子在磁场中有不磁分析器依据不同质量的离子在磁场中有不同的运动行为，从而将离子分开。主要有两种形同的运动行为，从而将离子分开。主要有两种形式单聚焦分析器和

38、双聚焦分析器。式单聚焦分析器和双聚焦分析器。 UzmBR21044. 1 单聚焦分析器只有一个磁场，当磁场强度和加单聚焦分析器只有一个磁场，当磁场强度和加速电场的电压不变时，离子运动的轨道半径仅仅速电场的电压不变时，离子运动的轨道半径仅仅取决于离子本身的质荷比取决于离子本身的质荷比(mz)。因此，具有不。因此，具有不同质荷比的离子，由于运动半径的不同而被分析同质荷比的离子，由于运动半径的不同而被分析器分开。器分开。 缺点是分辨率较低，设计良好的单聚焦分析器缺点是分辨率较低，设计良好的单聚焦分析器的分辨率可达的分辨率可达5000。它只适、化学电离源。合于。它只适、化学电离源。合于离子能量分散较小

39、的离子源，如电子轰击源离子能量分散较小的离子源，如电子轰击源单聚焦分析器单聚焦分析器双聚焦分析器双聚焦分析器 在单聚焦分析器中，离子源产生的离子在进在单聚焦分析器中，离子源产生的离子在进入加速电场之前，其初始能量并不为零，且各不入加速电场之前，其初始能量并不为零，且各不相同。若具有相同的质荷比的离子，其初始能量相同。若具有相同的质荷比的离子，其初始能量存在差异，在通过分析器后，是不能完全聚焦在存在差异，在通过分析器后，是不能完全聚焦在一起。为了解决离子能量分散的问题，提高分辨一起。为了解决离子能量分散的问题，提高分辨率，可采用双聚焦分析器。所谓双聚焦，是指同率，可采用双聚焦分析器。所谓双聚焦，

40、是指同时实现方向聚焦和能量聚焦。时实现方向聚焦和能量聚焦。 双聚焦分析器除了磁场外，还有一个静电场，双聚焦分析器除了磁场外，还有一个静电场，具有质量色散和能量色散，能够实现方向聚焦。具有质量色散和能量色散，能够实现方向聚焦。(2)四极分析器四极分析器 由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。 四极质量分析器的工作原理与扇形磁场是不四极质量分析器的工作原理与扇形磁场是不同的。扇形磁场靠离子动量的差别而把不同质荷同的。扇形磁场靠离子动量的差别而把不

41、同质荷比的离子分开，而四极质量分析器则是靠质荷比比的离子分开，而四极质量分析器则是靠质荷比不同把离子分开。四极质量分析器又称四极滤质不同把离子分开。四极质量分析器又称四极滤质器。当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离器。当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（或某一范围）质荷比的离子能够到达收集器并发或某一范围）质荷比的离子能够到达收集器并发出信号（称共振离子），其它离子在运动的过程出信号（称共振离子），其它离子在运动的过程中撞击

42、在筒形电极上而被中撞击在筒形电极上而被“过滤过滤”掉，最后被真掉，最后被真空泵抽走（称为非共振离子）。空泵抽走（称为非共振离子）。 因此，四极场只允许一种具有适当稳定振幅因此，四极场只允许一种具有适当稳定振幅质荷比的离子通过。四个电极上的交流和直流电压质荷比的离子通过。四个电极上的交流和直流电压从零到一最大值同步增加，可使不同质荷比的离子从零到一最大值同步增加，可使不同质荷比的离子依次分离，按顺序通过四极场实现质量扫描。其扫依次分离，按顺序通过四极场实现质量扫描。其扫描范围可由交流和直流的电压来调节。如果使交流描范围可由交流和直流的电压来调节。如果使交流电压的频率不变而连续地改变直流和交流电压

43、的大电压的频率不变而连续地改变直流和交流电压的大小（但要保持它们的比例不变，电压扫描），或保小（但要保持它们的比例不变，电压扫描），或保持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器而描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器而得到质谱图。得到质谱图。 优点：优点：分辨率较高；分辨率较高；分析速度极快，满质量范围扫描一般只需几毫分析速度极快，满质量范围扫描一般只需几毫秒；秒；制作工艺简单，仪器紧凑，制作工艺简单，仪器紧凑，最适合与气相色谱最适合与气相色谱和高效液相色谱仪联用。和高效液相色谱仪联用。缺点：缺点：质

44、量测量上限为质量测量上限为20004000Da；准确度和精密度低于磁偏转型质量分析器。准确度和精密度低于磁偏转型质量分析器。 四极质量分析器的优缺点四极质量分析器的优缺点 离子阱分析器近几年开始作为一种简易的质离子阱分析器近几年开始作为一种简易的质谱仪而出现的，一般与毛细管气相色谱仪联用。谱仪而出现的，一般与毛细管气相色谱仪联用。它的离子源与质量分析器同处一室。由色谱仪流它的离子源与质量分析器同处一室。由色谱仪流出的组分直接送入兼作离子源和分析器的阱内。出的组分直接送入兼作离子源和分析器的阱内。(3)离子阱离子阱 离子阱的特点是结构小巧，质量轻，灵敏度离子阱的特点是结构小巧，质量轻，灵敏度高，

45、而且还有多级质谱功能，它可以用于高，而且还有多级质谱功能，它可以用于 GC-MS，也可以用于，也可以用于 LC-MS。 离子阱的主体是一个环电极和上下两个端盖离子阱的主体是一个环电极和上下两个端盖电极，环电极和上下两端盖电极都是绕电极，环电极和上下两端盖电极都是绕 z轴旋转轴旋转的双曲面，直流电压的双曲面，直流电压 U 和射频电压和射频电压 V加在环电极加在环电极和端盖电极之间。和端盖电极之间。 离子阱构造离子阱构造 飞行时间质量分析器（飞行时间质量分析器（time of flight analyzer）的主要部分是一个离子漂移管。样品受到阴极灯）的主要部分是一个离子漂移管。样品受到阴极灯丝发

46、出的电子轰击后变成离子，栅极丝发出的电子轰击后变成离子，栅极G1上的负脉上的负脉冲将离子引出离子室，冲将离子引出离子室，G1，G2间的直流电压差使间的直流电压差使离子受到加速并进入无场漂移管，最终按离子受到加速并进入无场漂移管，最终按mz值值不同先后到达离子接收极。不同先后到达离子接收极。 (4)飞行时间分析器飞行时间分析器1-电离室；电离室；2-电子接收极；电子接收极；3-阴极；阴极；4-离子接收极离子接收极 212mvzV122()zVvm根据离子运动动能与电场势能的关系式：根据离子运动动能与电场势能的关系式：可以推导为：可以推导为：12()2mTLzV 离子以速度离子以速度进入漂移区，假

47、定离子在漂移区进入漂移区，假定离子在漂移区飞行的时间为飞行的时间为 T，漂移区长度为，漂移区长度为 L，则可得：，则可得： 因此，离子在漂移管中飞行的时间与离子质因此，离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的平方根成正比。对于能量相同的离子，离子量的平方根成正比。对于能量相同的离子，离子的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量的质量越大，达到接收器所用的时间越长，质量越小，所用时间越短。根据这一原理，可以把不越小，所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子分开。同质量的离子分开。 飞行时间质量分析器的特点是质量范围宽，飞行时间质量分析器的特点是质量范围宽，扫描速度快，既不需要电场，也不需要

48、磁场。但扫描速度快，既不需要电场，也不需要磁场。但是，存在分辨率低这一缺点。是，存在分辨率低这一缺点。 造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。这样，管前的时间分散、空间分散和能量分散。这样，即使是质量相同的离子，由于产生时间的先后不即使是质量相同的离子，由于产生时间的先后不同，产生空间位置不同和初始动能的不同，达到同，产生空间位置不同和初始动能的不同，达到检测器的时间就不相同，因而降低了分辨率。检测器的时间就不相同，因而降低了分辨率。 目前，采用离子延迟引出技术和离子反射技目前，采用离子延迟引出技术和离子反射技术，可以在

49、很大程度上克服上述术，可以在很大程度上克服上述3个原因造成的个原因造成的分辨率下降。分辨率下降。 通过离子反射技术，质量相同能量不同的通过离子反射技术，质量相同能量不同的离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。1-离子源；离子源；2-检测器；检测器；3-反射器反射器 离子不是直线飞行，而是在中途被反射后再离子不是直线飞

50、行，而是在中途被反射后再到达检测器。这种方法有两点好处到达检测器。这种方法有两点好处: 系统具有系统具有 “双聚焦双聚焦”功能，相同质量不功能，相同质量不同能量的离子被反射后能同时到达检测器；同能量的离子被反射后能同时到达检测器； 离子的飞行路程增加了一倍。两者均有离子的飞行路程增加了一倍。两者均有助于提高仪器的分辨率。助于提高仪器的分辨率。 飞行时间质谱仪的分辨率可达飞行时间质谱仪的分辨率可达 20000 以上，以上，最高可检质量超过最高可检质量超过 300 000Da，并且具有很高的，并且具有很高的灵敏度。灵敏度。(5)傅立叶变换离子回旋共振分析器傅立叶变换离子回旋共振分析器 傅里叶变换离

51、子回旋共振分析器（傅里叶变换离子回旋共振分析器（Fourier transform ion cyclotron resonance analyzer，FTICR）是在原来回旋共振分析器的基础上发展起）是在原来回旋共振分析器的基础上发展起来的。假定质荷比为来的。假定质荷比为 m /z的离子进入磁感应强度的离子进入磁感应强度为为 B 的磁场中，由于受磁场力的作用，离子做圆的磁场中，由于受磁场力的作用，离子做圆周运动（半径周运动（半径 R），如果没有能量的损失和增加），如果没有能量的损失和增加，圆周运动的离心力和磁场力相平衡，可得到：，圆周运动的离心力和磁场力相平衡，可得到：e为离子运动的回旋频率（

52、单位为弧度为离子运动的回旋频率（单位为弧度 / /秒）秒） 可以看出，离子的回旋频率与离子的质荷比可以看出，离子的回旋频率与离子的质荷比成线性关系，当磁场强度固定后，只需精确测得成线性关系，当磁场强度固定后，只需精确测得离子的共振频率，就能准确地得到离子的质量。离子的共振频率，就能准确地得到离子的质量。 测定离子共振频率的办法是外加一个射频辐测定离子共振频率的办法是外加一个射频辐射，如果外加射频频率等于离子共振频率，离子射，如果外加射频频率等于离子共振频率，离子就会吸收外加辐射能量而改变圆周运动的轨道，就会吸收外加辐射能量而改变圆周运动的轨道，作螺旋加速运动，离子收集器放在适当的位置就作螺旋加

53、速运动，离子收集器放在适当的位置就能收到共振离子。改变辐射频率，就可以接收到能收到共振离子。改变辐射频率，就可以接收到不同的离子。不同的离子。 普通的回旋共振分析器扫描速度很慢，灵普通的回旋共振分析器扫描速度很慢，灵敏度低，分辨率也很差。傅里叶变换离子回旋敏度低，分辨率也很差。傅里叶变换离子回旋共振分析器采用了线性调频脉冲来激发离子，共振分析器采用了线性调频脉冲来激发离子，即在很短的时间内进行快速频率扫描，使很宽即在很短的时间内进行快速频率扫描，使很宽范围分布的质荷比离子几乎同时受到激发，因范围分布的质荷比离子几乎同时受到激发，因而扫描速度和灵敏度比普通回旋共振分析器高而扫描速度和灵敏度比普通

54、回旋共振分析器高得多。得多。 傅里叶变换离子回旋共振分析器示意图傅里叶变换离子回旋共振分析器示意图 质量分析室是一个立方体结构，由质量分析室是一个立方体结构，由 3 对相互对相互垂直的平行板电极组成，置于高真空和由超导磁垂直的平行板电极组成，置于高真空和由超导磁体产生的强磁场中。体产生的强磁场中。第一对电极为捕集极，第一对电极为捕集极，它与磁场方向垂直，电它与磁场方向垂直，电极上加有适当正电压，极上加有适当正电压，其目的是延长离子在室其目的是延长离子在室内的滞留时间；内的滞留时间；第二对电极为发射极，第二对电极为发射极，用于发射射频脉冲；用于发射射频脉冲；第三对电极为接收极，第三对电极为接收极

55、，用来接收离子产生的信用来接收离子产生的信号。号。 样品离子引入分析室后，在强磁场作用下被样品离子引入分析室后，在强磁场作用下被迫以很小的轨道半径做回旋运动，由于离子都是迫以很小的轨道半径做回旋运动，由于离子都是以随机的方式运动，因此不产生可检出的信号。以随机的方式运动，因此不产生可检出的信号。如果在发射极上施加一个很快的扫频电压，当射如果在发射极上施加一个很快的扫频电压，当射频频率和某离子的回旋频率一致时，共振条件得频频率和某离子的回旋频率一致时，共振条件得到满足。离子吸收射频能量，轨道半径逐渐增大到满足。离子吸收射频能量，轨道半径逐渐增大，变成螺旋运动，经过一段时间的相互作用和能，变成螺旋

56、运动，经过一段时间的相互作用和能量传递，所有离子都做共振运动，产生可被检出量传递，所有离子都做共振运动，产生可被检出的信号。的信号。 共振运动的正离子运动至靠近接收极的一个共振运动的正离子运动至靠近接收极的一个极板时，吸收此极板表面的电子，当其继续运动极板时，吸收此极板表面的电子，当其继续运动到另一极板时，又会吸引另一极板表面的电子。到另一极板时，又会吸引另一极板表面的电子。这样便会感生出所谓的这样便会感生出所谓的“相电流相电流”。相电流是一。相电流是一种正弦形式的时间域信号，正弦波的频率和离子种正弦形式的时间域信号，正弦波的频率和离子的固有回旋频率相同，其振幅则与分析室中该质的固有回旋频率相

57、同，其振幅则与分析室中该质量的离子数目成正比。量的离子数目成正比。 如果分析室中各种质量的离子都满足共振如果分析室中各种质量的离子都满足共振条件，那么，实际测得的信号是同一时间内做条件，那么，实际测得的信号是同一时间内做共振轨道运动的各种离子所对应的正弦波信号共振轨道运动的各种离子所对应的正弦波信号的叠加。将测得的时间域信号重复累加，放大的叠加。将测得的时间域信号重复累加，放大并经模数转换后输入计算机进行快速傅里叶变并经模数转换后输入计算机进行快速傅里叶变换，便可检出各种频率成分，然后利用频率和换，便可检出各种频率成分，然后利用频率和质量的已知关系，便可得到常见的质谱图。质量的已知关系，便可得

58、到常见的质谱图。 FT-MS 有很多明显的优点：有很多明显的优点：分辨率极高，商品仪器的分辨可超过分辨率极高，商品仪器的分辨可超过106。分析灵敏度高，且在高灵敏度下可以得到高分析灵敏度高，且在高灵敏度下可以得到高分辨率。分辨率。具有多级质谱功能。具有多级质谱功能。可以和任何离子源相连，拓展了仪器功能。可以和任何离子源相连，拓展了仪器功能。扫描速度快，性能稳定可靠，质量范围宽。扫描速度快，性能稳定可靠，质量范围宽。 当然，当然，FT-MS 由于需要很高的超导磁场，由于需要很高的超导磁场，因而需要液氦，仪器售价和运行费用都比较贵。因而需要液氦，仪器售价和运行费用都比较贵。几种几种质量分析器优缺点

59、对比质量分析器优缺点对比优点优点缺点缺点磁分析器磁分析器 价廉价廉分子离子分辨率低。分子离子分辨率低。四极杆四极杆质量精度高，分辨率好质量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不碰撞能量低，碎片不完全完全离子阱离子阱相对价廉，质量精度高，分相对价廉，质量精度高，分辨率好，适合多级质谱辨率好，适合多级质谱低能量碰撞低能量碰撞TOF质量精度高，分辨率好，质量精度高，分辨率好，ESI、MALDI均可接均可接需高真空，价高需高真空，价高FTMS质量精度最高，分子离子分质量精度最高，分子离子分辨率好，非常适合多级质谱辨率好，非常适合多级质谱低能量碰撞，需超导低能量碰撞，需超导磁体，价高磁体，价高5. 检测与记

60、录检测与记录 电子倍增器是现代质谱仪广泛使用的检测装电子倍增器是现代质谱仪广泛使用的检测装置。一般具有置。一般具有1020个电极（铍铜合金或其他个电极（铍铜合金或其他材料）。材料）。检测检测 从质量分析器射出的具有一定能量的离子，从质量分析器射出的具有一定能量的离子，打在第一极上并产生较多的二次电子，这些电子打在第一极上并产生较多的二次电子，这些电子打在第三极上又产生数量更多的三次电子，在每打在第三极上又产生数量更多的三次电子，在每一极上都重复这一过程。这样经过多极使电子不一极上都重复这一过程。这样经过多极使电子不断倍增，最后被检测。断倍增，最后被检测。 电子倍增器响应快，灵敏度高。随着使用时