实验4+紫外吸收法测定蛋白质含量

1、实验七实验七 紫外吸收法测定蛋白质含量紫外吸收法测定蛋白质含量一、一、 实验目的：实验目的： 学习紫外分光光度法测定蛋学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；白质含量的原理； 熟练掌握紫外分光光度计测熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。定原理及使用方法。二、二、 实验原理：实验原理： 由于蛋白质中存在着由于蛋白质中存在着酪氨酸、色氨酸及苯酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸丙氨酸残基，它们的结构中具有残基，它们的结构中具有共轭双键共轭双键，对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值密度值OD280nm与

2、其浓度（范围是与其浓度（范围是0.11.0mg/ml）成正比关系，）成正比关系，280nm的吸的吸光度故可作为蛋白质定量测定的依据。光度故可作为蛋白质定量测定的依据。 本法操作简便迅速，且不消耗样品本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收可以回收)，低，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情量测定，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。况的检测。 核酸在核酸在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生波长

3、下也有一定吸收能力，可能发生干扰。干扰。混有核酸时必须分别测定混有核酸时必须分别测定280nm和和260nm两两处的处的OD值，然后根据两种波长的吸收度的比值，值，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。三、三、 实验材料、主要仪器和试剂实验材料、主要仪器和试剂 1试验材料：待测的蛋白质溶液。试验材料：待测的蛋白质溶液。 2 主要仪器：主要仪器：（1）紫外分光光度计）紫外分光光度计（2）试管与试管架）试管与试管架（3）移液管）移液管 3

4、试剂：浓度为试剂：浓度为1mg/mL标准酪蛋白标准酪蛋白溶液溶液四、操作步骤四、操作步骤 1标准曲线制作标准曲线制作 按表按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为匀。以光程为1cm的石英比色杯，在的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。 以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。标，绘出标准曲线。 2样品测定：样品测定： 取待测蛋白质溶液取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水，加入蒸馏水9mL，混匀，按上述方法测定混匀，按上述方法测定280nm的光密度

5、，的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。的浓度。分光光度计的使用分光光度计的使用分光光度计的分类分光光度计的分类分光光度计的分类分光光度计的分类红外分光光度计红外分光光度计:可见光分光光度计可见光分光光度计:紫外分光光度计紫外分光光度计:测定波长范围为测定波长范围为大于大于760 nm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400760 nm的可见光区的可见光区测定波长范围为测定波长范围为200200400 400 nmnm的紫外光区的紫外光区分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括无论哪一类分光光度计都

6、包括 ：光源、：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示件的次序如图所示: : 紫外分光光度计紫外分光光度计 1光源：钨灯或卤钨灯光源：钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 400760nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200400nm 2单色器：单色器：把混合光波分解为单把混合光波分解为单波长光的波长光的装置装置3吸收池吸收池（比色皿）（比色皿） ：玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区石英石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区见光区 4检测器：将光信号转变

7、为电信号的装置检测器：将光信号转变为电信号的装置5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统紫外可见分光光度计使用方法（紫外可见分光光度计使用方法（1 1）（1） 测试准备测试准备 仪器预热仪器预热30min后方可进行测试。后方可进行测试。 将盛有将盛有“空白空白”或或“对照对照”溶液的比色皿处于试样室光路溶液的比色皿处于试样室光路位置；位置； 选择波长选择波长 确定光源确定光源 （2）测试过程）测试过程 数字显示透光度数字显示透光度“100.0”(或吸光度或吸光度“0.00”)23s后，后，将盛有标准溶液的比色皿移至光路将盛有标准溶液的比色皿移至光路 将盛有样品溶液的比色皿移至

8、光路，记录该样品的数据。将盛有样品溶液的比色皿移至光路，记录该样品的数据。待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光路路，若有多个样品，操作以此类推。，若有多个样品，操作以此类推。分光光度计使用注意事项分光光度计使用注意事项 （1） 预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。 （2） 在波长在波长320nm以下的实验范围一定要选用石英比色皿，以下的实验范围一定要选用石英比色皿，绝不可以玻璃比色皿替代。绝不可以玻璃比色皿替代。 （3）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要

9、比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。先用自来水将用过的比色皿反复冲洗，然将比色皿清洗干净。先用自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋洗，倒立于滤纸片上，待干后再收回比色皿盒中。后用蒸馏水淋洗，倒立于滤纸片上，待干后再收回比色皿盒中。必要时，还要对比色皿进行更精细的处理，如用浓硝酸或铬酸必要时，还要对比色皿进行更精细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。洗液浸泡、冲洗。 （4）比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验比色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验误差。误差。 (4) 比色皿内盛液应为其容量的比色皿内盛液应为其容量的2/33/4，过少会，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。仪器。 (5) 拿放比色皿时，应持其拿放比色皿时，应持其“毛面毛面”，杜绝接触，杜绝接触光路通过的光路通