肽核酸的合成、修饰和应用

1、有机化学Chinese Journal of Organic Chemistry2005年第25卷第3期,#263Vol. 25, 2005No. 3, # 263综述与进展肽核酸的合成、修饰和应用褚征刘克良*（军事医学科学院毒物药物研究所北京100850）摘要 肽核酸是寡核苷酸模拟物，它的糖-磷酸骨架被N-（2-氨基乙基）甘氨酸骨架所代替.为了优化肽核酸的性质，各 种结构的肽核酸（PNA）单体被合成出来.综述了肽核酸的合成、结构修饰及应用关键词 肽核酸；合成；修饰；应用Peptide Nucleic Acid (PNA): Syn thesis, Modificatio ns andAppl

2、icati onsCHU, ZhengLIU, Ke-Liang *(Institute of Pharmacology and Toxicology , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850)AbstractPeptide n ucleic acid (PNA) is DNA mimic, i n which the sugar-phosphate backb one is replacedby a N-(2-aminoethyl)glycine polyamide structure. For optimizing th

3、e characteristics, various PNA monomers had bee n syn thesized. The syn thesis, modificati ons and applicati ons of PNA are reviewed. Keywords PNA; syn thesis; modificatio n; applicati on有机化学Chinese Journal of Organic Chemistry2005年第25卷第3期,#263Vol. 25, 2005No. 3, # 263有机化学Chinese Journal of Organic

4、Chemistry2005年第25卷第3期,#263Vol. 25, 2005No. 3, # 263DMABaseHaseIIPNA寡核苷酸在治疗用药物、分子生物学研究工具及诊 断试剂上应用广泛.寡核苷酸应用的主要制约在于它容 易被核酸酶所降解、杂交后热稳定性差以及会与蛋白等 非特异性结合等.为改造寡核苷酸的理化和生物学特 性，许多寡核苷酸类似物被研究岀来.肽核酸是寡核苷酸模拟物中的较为重要的一种1991年Nielsen等报道了用N-（2-氨基乙基）甘氨 酸骨架代替糖 -磷酸酯骨架作为重复结构单元（图1）,合 成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸 （Peptide nucleic ac

5、id, PNA）.尽管 PNA 在结构上相对寡 核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结 合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性，有较强的抗核酸酶和蛋白水解酶降解 的能力.科研人员设计合成了各种结构的PNA,以优化其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性，并将PNA应用于诊断和治疗等方面，从而开创了一个新的研究领域.本文对PNA的合成、修饰和应用图1核糖核酸和肽核酸骨架结构对比Figure 1 Comparison of the backbones of DNA and PNA进行综述1 PNA 单体的合成各种各样的构建模块被用于合成PNA及其类似物有机

6、化学Chinese Journal of Organic Chemistry2005年第25卷第3期,#263Vol. 25, 2005No. 3, # 263有机化学Chinese Journal of Organic Chemistry2005年第25卷第3期,#263Vol. 25, 2005No. 3, # 263E-mail: keliangliuReceived October 14, 2003; revised April 5, 2004; accepted July 4, 2004.No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用255No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#包括

7、骨架结构、在N-（2-氨基乙基）甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等.1.1 经典的PNA骨架合成BdcHNOHBocHNOH_ BejcHMii经典的PNA的骨架单体是N-（2-氨基乙基）甘氨酸,在甘氨酸的氮上连接碱基的衍生物.通常先合成端基N有保护基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再将碱基衍生物连在未受保护的氮上.常用的方法有：1.1.1烷基化反应以乙二胺或氨基乙腈为原料，与卤代乙酸衍生物进 行烷基化反应，适用的保护基（protect group, PG）有：芴5甲氧酰基（9-fluore nylmethyloxycarbo nyl, Fmoc）、对甲 氧基苯基二苯甲基（4-methoxy

8、phe nyldiphe nylmethyl,Mmt）、叔丁氧羰基（tert-butyloxycarbonyl, Boc）® （图 2）.and condilions：(BocjO, NaOH. FO： (ii KIO4, H2O; i)H ChNH2COOCH NaCNWH _图3由甘氨酸酯和氨基丙二醇合成PNA骨架Figure 3 Synthesis of PNA backbones from 3-amino-1,2-pro- panediolH °H2 flCIzII山a恥、“ N S CH3HReagents and condiSons:讪 H?/Pd.rG: HQ

9、; (ii) MeOH/HCI; (iii) Mmt-CI, DMF; NEt3or Fmoc-ONSu. dioxane/H： MeOH/HCI图4由乙二胺和乙醛酸合成PNA骨架Figure 4 Synthesis of PNA backbones from 1,2-diaminoethane and glyoxylic acidH QHH N-OCH3BocHN 0HDocf IN -H B如'A。处畑庐n£ and condilions：(i) DrCIbCQODu-i.CIbCI： (ii) Fmoc-QNSu, DIELAl5 or £i) GC ICOQ

10、II, EtOH/HCI; (ii) Mmr-CI,CH2Chr61; (iii (Bdc)2O, NEl3； CH2CIs; (iv) ClCH2 COOBu< NEt.s. CH?CI/ v) (Boc)>0. CH7CI2; (vi) Raney-Ni, 10% NHE:OH; ；vii) BrCH2COOEt, K-.'C&lite, CH3CNReagents and corditicns;0 HN(QCH?)CH?; TEA. 7BTU/TEA; (ii) LiAIH4,10% citric acid; (iii) NaCNBH., 3% AcOH/Me

11、OH图5由甘氨酸合成PNA骨架Figure 5 Synthesis of PNA backbones from glycine ester图2烷基化反应合成 PNA骨架Figure 2 Synthesis of PNA backbones by alkylation1.1.2 席夫碱的还原反应还原甘氨酸酯与保护的氨基乙醛形成的席夫碱虽然只适用于Boc保护基，但该方法稍加修改即可用于 合成各种有侧链的PNA单体抄（图3）.还原乙二胺与乙醛酸形成的席夫碱，得到N-（2-氨基乙基）甘氨酸，然后再选择连接适当的保护基，有Fmoc11和 Mmt12等（图 4）.先将甘氨酸还原成Boc氨基乙醛，再与甘氨酸

12、酯反应叫图5）.1.1.3 Mitsu nobu反应利用氨基乙醇与对硝基苯基甲磺酰基（o-NBS）保护的甘氨酸甲酯进行Mitsunobu反应14（图6）.BocHN'”°H/<a-NBS-HN、h IIOAHogHN""HNCOOCHaReagents and conditions:(i) TPP, DEAD. THF; (ii) PhSH, K2COL.CH;CN图6由氨基乙醇和甘氨酸甲酯合成PNA骨架Figure 6 Synthesis of PNA backbones from glycine ester1.2在骨架上引入碱基四种碱基都是经胺的

13、烷基化反应形成碱基乙酸衍 生物，再采用通常的多肽合成的方法，联结碱基乙酸和 骨架上的未受保护的氮.胸腺嘧啶的烷基化反应通常不需要使用保护基团No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用257因此当与溴乙酸酯反应再经皂化口5 或直接与溴乙酸反应16即可得胸腺嘧啶乙酸(图7).0HReagents and conditions;Method (i) BrCHjCOOCH K200；h MF： (ii) NaOH. H20Method 2f1Gl: BrCH2COOH. KOH; H2O图7胸腺嘧啶乙酸的合成Figure 7 Synthesis of thyminyl acetic acid其余三种碱

14、基上都有活泼基团，需先加以保护. 胞嘧啶上的 活泼基团为4位上的氨基,可选择的保5护基有：苄氧羰基(benzyloxycarbonyl, Cbz)、对叔丁基11苯甲酰基(4-tert-butylbenzoyl, 4- t-BuBz)、苯甲酰基1712(benzoyl, Bz)以及Mmt 等，再与溴乙酸酯进行烷基化反应，然后皂化即得 胞嘧啶乙酸的衍生物(图8).腺嘌呤的保 护过程与胞嘧啶基本相同，可用的保护基有 Cbz5, Mmt 12,对甲氧基苯基13(anisoly. An)(图 9).9鸟嘌吟的保护比较复杂，需要在 N的烷基化的 过 程中避免N?烷基化的 副反应干扰.一种常用的方法是 在烷

15、基化中用2-氨基-6-氯嘌吟，烷基化后再在酸性或碱性 条件下回流，将氯水解转化为羰基，过程如 图 10a5, 10b11.或是直接烷基化N2连有保护基的腺 嘌吟,79色谱分离N /N两种烷基化 产物，然后皂化得 鸟嘌吟乙 酸的衍生物12(图10c).No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#PGR iiiiiiRef.CBzt-BuCbz-Cl, DMAP, pyridineBrCH2COOBu-t, K2CO3, CS2CO3, DMFHCl/dioxane,

16、 CH 2CI254-t-BuBzMet-BuBz-Cl, pyridineBrCHzCOOMe, NaH, DMFNaOH, H 2O/dioxane11BzEtBz-Cl, pyridineBrCHzCOOEt, K2CO3NaOH, H 2O17MmtMeMmt-Cl, pyridineBrCH2COOMe, NaH, DMFNaOH, H 2O/dioxane12图8合成胞嘧啶乙酸的衍生物Figure 8 Synthesis of cytosyl acetic acid derivativesNNNH一 NPhPG Ri iiiiiRefCbzt-BuNaH,Cbz-Cl, DMFBr

17、CH 2COOBu-t, K2CO3, CS2CO3, DMFTHF, CH 2CI2, Et3SiH5MmtMeMmt-Cl, pyridineBrCH 2COOMe, NaH, DMFNaOH, H2O/dioxane12AnMeAn-Cl, pyridineBrCH 2COOMe, NaH, DMFNaOH, H2O/dioxane13图9合成腺嘌吟乙酸的衍生物Figure 9 Synthesis of adenyl acetic acid derivativesOCHOHReagents and conditions：(i) BrCH2CH=Ch2. K2CO31 DMF; (ii)

18、HCI. reflux; fiii) Gfcz-imidazolidc, H, THF： (iv) O31 CH£CI£. McOH; <v) kte西; (vi) NaCIOz, NaH2PO4, H2O. THF. J-BuOH, 2-methyl-2-butene; (vii) BrGHCOOMe, NaH, DMF; (viii) Mmt-CI, pyridine. NEt3： (ix) NaOH, H2O/dioxane： (xj Isobutyryl chloride, NEL3, DMF：阿 BrGHCOOMe, NaH. DMF： fxiij NaOH

19、. H2O/dioxane图10鸟嘌吟乙酸的衍生物的合成Figure 10 Synthesis of guanyl acetic acid derivativesNo. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#1.3 对经典PNA的改造1.3.1 PNA 骨架的修饰目前，PNA合成的研究集中在骨架修饰 PNA衍生 物上，是因为用改造和未改造的 PNA单体，混合制成骨 架的寡核苷酸类似物对 DNA和RNA有更好的杂交特 性18,而且骨架修饰能优化 PNA的特性，如水溶性、生 物利用度等.延长骨架碳链会使PNA杂交活性显著降 低19.当前研究较多的有以 下几

20、个方面.1.3.1.1 在骨架上引入支链引入支链可使单体成为手性分子，而对杂交性质则 影响很小20.常用几种引入侧链方法包括对经典单体 合成方法的改进，利用各种天然a-氨基酸引入支 链10'20'21,14、不对称催化氢化反应22、Ugi 4CC反应23(图 11)等.前三种方法是对经典PNA单体合成方法的改进.其好处在于可以利用各种天然或非天然氨基酸原料，原料易得，支链结构类型多.第四种方法由于用到了不对 称催化氢化，需用光学纯催化剂，现已不再应用.第五 种方法是以异腈、羧酸、胺、醛或 酮为原料的多 组份缩合反应.图11给岀的仅为其中一例，四种组份分别为对 叔丁 基-1-环己

21、 烯基异腈(4-t-Bu-cyclohex-1-e nyl iso- cya nde)、N2-苄氧羰基-N9-羧乙基 鸟嘌吟(N2-Z- N2-car- boxymethylguanine)、单叔丁氧羰基乙二胺(mono-Boc-ethylendiamine)、三甲基乙醛(pivalaldehyde).此合成方 法简单，并可引入某些 特殊的支链，能大大扩展PNA的 种类.1.3.1.2 在骨架上引入环状结构带有环状结构的PNA有很多，其合成过程各异，脯 氨酸由于其天然结构特 点成为研究的主要热 点.以下给 岀几个具有代 表性的由4-羟基脯氨酸或四 氢吡咯衍生 物制备的骨架 含五元环结构的 PN

22、A单体的合成 途径. 图1224声其它带有环状结构的PNA单体还有同为五元环的 1曲，229, 330 , 4列，及六元环的严,623以及带有硫原 子的 7, 833(图 13).环状结构的引入对PNA的性质带来许多新的变化. 如对3的研究表明，其光学异构体对Tm的影响是不一致 的.含有一个(2S,4R)单体的PNA2 : DNA的Tm值比纯经 典PNA单体的 PNA2 : DNA 的Tm值提高了 14 C ,而 (2S,4S)则降低了 20 C.因此，对于骨架中有 环状结构 的PNA单体应成为 今后研究的一个重 点.1.3.2 改变碱基与骨架的联接位置与方式，采用非酰胺键的方式将碱基联于骨架

23、中的碳原子上文献报道中主要有以 下几种连接方 式(图14):碱基 与骨架以 无羰基的直链 C C键连接934;以烯键连接 1035;以环状结构连接1136.但由于这种改造方 式使 得PNA的结构有 很大改变，有可能会对杂交性 质产生 较大的负面影响.如Abdel-Aziz 等对单体 9的研究发No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用259H2N, .COOR"R'BdcHN抄iiHGR1 N-OCH 帀ABocHNBocHNBocHNh3coONl ICbzOCH2OO 13R-pCH3C NBS-HNNHCbzHXOBccHNH

24、BocHNBdcHNCQOCI l3BocHN,.N_COOR2CHONHBocVOH1/I HCOOCH3NUCbzH .NFtGz°YJNHBdcNHBocNo. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#Reagents and conditions' (i) NaCNBH, 3% CH-3COOWMeOH; (ii) HN(OCHj)CHa. TEA. TBTUATEA; (iii) LiAIH4. 10% citric acid; (iv) NaCN0Ha. 3% CH3COOH/MeOH;M TPP DEAD： THF; J PhSHr K2COL, CH3CN： vi

25、i) RCHO: TMG.THF： (viii) Et-DuPHOS-RH1. MeOH; H2： ix) JV-Boc glycine aldehyde. HPd/C (x) M&OH; (xi) 1.7% HCDTHF图11合成带有侧链的手性 PNA单体Figure 11 Synthetic methods of the chiral PNA monomers with side chainMeOZOHO -HCI HN<COOEtO'OHCOO ELBocHNBocHNHQCOOHNnE /-"N %COO MeOCMe3 .xviii xxliMI -廿

26、“BucBncHNVII - iXOS02CH3COOELRHNCOOHNXVIl - XXL?；COOHBccHNo丿伽BocRragfiints and ronditiiDns:(i) j-Ftenzoylthymine, DEAD, PPhs, Benzene； (ii) LiBH THr； (iii) TsCl, pyridine' (iv) NaM, DMr； (w) Raney-Ni, H?; (ui) Rqc-N, NFt. DM SO; (vii) Pd/C, H?; (wiiij BrCHCOOEl, CHCN, KF/Cnlilc; (be) NaOH, MeOH/

27、H2O; (x) BcinNHCl-CHjBr, NEt3, DMF; (xi) CH朋吐Cl, NEta. CH2CI2; (xii) KjCO3, DMF, 1& crown 6; (xiii) blaOH. H2OMtOH: xiv) (Bcc)20i NaOH. IHF/H2Q; (kv CHNn： elher/diOKan& xvi) CH3OT$, Ph3P, DEAD, THF： (xull NsN3； DMF: (xvlli； Pd/C. H2： xix Cbz-CI; Na3COa：TFA:DCM (1:1： fxxi) Thy-CH2COOHn DCC. H

28、OBT: (xxii)1 mul/L Ns OH;(Kxiii) (BocO, NaOH. H:O: (xxiv) MsCI. CH2CI2: (kxv) LiN5. DMF; (xxvi) Ph3P. HQ THF; (xxvii) Allyl bmmoacetale, NEt3. THF; xviii> Thy- CH2COOH. HBTU, DIEA, DMF: (xxix) PhJC, Bu35nH. AcOH, CHZCIZ图12合成骨架中含有环状结构 PNA单体Figure 12 Synthetic methods of the PNA monomers with cycli

29、c structure in backbone现，对于12聚的PNA低聚体，两端用单体9替换其中单体，就会显著降 低Tm值.单体全部为9的低聚体，则13个经典单体，只使其与DNA和RNA杂交的Tm值没有观察到其与DNA或RNA的杂交.略有降低( Tm< 10 C ),而在低聚体的中间 插入一个No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用2611.4 PNA 低聚体的合成PNA之间的连接类似于多肽 ，因此PNA的合成可(4) Monomer + I iATU(5； DIEACoupling(7j NMP wash图13骨架中含有环状结构 PNA单体Figure 13 PNA monomers

30、 with cyclic structure in backbon采用多肽 固相合成技术.以Boc/Cbz保护策略为例，其 反应过程如图16所示41.BqgHN(1) Deprotection.TFA(2) DCM washv (3)NMPwashNo. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#H2N"Resin(fl) Capping,acetic anhydride(9) Piperidine口 3 忖MP wash图16 PNA的固相合成Figure 16 Solid synthetic process of the PNANo. 3褚征

31、等：肽核酸的合成、修饰和应用#图14碱基与骨架为非酰胺键结合的PNA单体Figure 14 PNA monomers with non-amide bond coupling backbone and base1.3.3 对碱基的替代图15中的12阿，1338, 1439, 1540已被试验用作碱基的替代物并观察到了与DNA的杂交图15碱基的模拟物Figure 15 Mimics of basePNA合成中应 注意选择合适的 N端和碱基保护 策 略.虽然PNA单体合成用到的保护基 很多，但由于受到 保护和脱除条件 及固相合成的 限制，并不是任意两个保 护基都能作为 PNA单体的N端和碱基保护基

32、对(N端/ 碱基)的保护策略.表1给岀文献中岀现的一些保护策 略.2 PNA 的应用2.1 治疗从理论上看,PNA有发展为反义药物的可能.主要 因为：(1) PNA 不能被核酸酶和蛋白酶降解 .(2)与DNA 和RNA的结合力强，特异性高.PNA与RNA结合的 稳定性远高于与DNA的结合.PNA 与DNA形成的No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用263表1 PNA合成的保护策略Ref. N端保护基Table 1 Protective strategy of PNA42Boc NoneCbz CbzCbzMBHA (4-methylbenzhyd

33、ryl) amine-polystyrene43Boc NoneCbz Bhoc(benzylhydroxycarbonyl)CbzHYCRON (hydroxycrotyloigoethylene)-resin44Boc NoneCbz Bzi-BuAminomethylpolystyrene5Fmoc NoneCbz CbzCbzMBHA-resin11Fmoc NoneMmtMmt MmtAminohexylsuccinyl-CPG12Mmt Nonet-BuBtAni-BuAminohexylsuccinyl-CPG45Dts (dithiasuccinoyl)None Cbz Cbz

34、CbzPolyethyleneglycol-polystyrene碱基保护基TCAG固相载体No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用#No. 3褚征等：肽核酸的合成、修饰和应用265PNA2/DNA 三螺旋 结构能 引起转录停止，PNA 与RNA 形成的PNA2/RNA能引起翻译停止46.这些特点都是反 义寡核苷酸所不具 备的.研究表明，PNA与mRNA结合能有效和特定地抑制 翻译.寡核苷酸的主要作用方 式是通过调控RNaseH的 降解作用47.而PNA主要依靠位阻影响，包括结合在 DNA抑制RNA酶的启动和延伸48、结合在 RNA转录 相关区抑制在转录区的结合和反应49、结合在RNA的 非

35、转录5'区以抑制与核糖体结合或 翻译50.由于三链PNA2/DNA和PNA2/RNA结构非常稳定, 因此PNA可以作为分子通道 阻滞剂用于抑制DNA或 RNA的酶反应.端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖 核酸和蛋白复合物，负责维持染色体复制后端粒末端长 度，用自身携带 RNA作模板，通过逆转录 合成DNA. PNA 可与体 外的端 粒酶中 RNA 有效和特异性的结 合51,这一特性在通 过脂质体将PNA导入的培养基细 胞中也得到了证实52.由于在恶性肿瘤细胞 中端粒酶 有特别的活性,PNA可作为端粒酶抑制剂，开发成有效 的抗癌药物.PNA有抗HIV的作用.研究显示PNA可以结合于 逆转

36、录酶的RNA模板阻碍逆转录酶的作用53,也可与 RNA结合，通过抑制HIV病毒复制的必要过程一一二 聚体的形成，来阻碍HIV的复制网.Tyler等55首先报道了仅通过腹腔注射，非修饰的 PNA就能够阻碍注射 进大脑的神经紧张素的作用，表 明PNA可能穿过了血脑屏障.其后，另一个研究小组的 Bonnard等56通过鼠腹腔注射抗阿片神经肽FF (NPFF) 的mRNA的反义PNA(三次,10 mg/kg), 观察到明显的 抑制抗阿片神经肽FF (NPFF)的作用.显示PNA穿透了 血脑屏障与NPFF的mRNA结合.Adlerzc等昭对培养的 鼠小脑粒细胞 和皮质星形胶质细胞 体外研究发现，未修 饰

37、PNA能大大下调阿耳茨海默病的一个致病因素淀粉状前 体蛋白(amyloid precursor protein, APP). 以上 的研究表明，PNA会在治疗中枢神经系统的基因相关病 症和研究中 发挥重要作用.三链结构的高稳定性 也使PNA可用于在 细胞内修 复突变的DNA. Faruqi等阿报道了 PNA能被吸收入鼠 体内，结合于基因靶 点，会导致点突 变、单碱基 缺失或 插入,其浓度只需要107 mol/L.此外，由于将PNA连 于质粒的特定部位，不会影响质粒 的正常生理功能，因 此PNA也可以作为药物载体，在其骨架上连接肽、蛋 白、药物用于基因治疗.2.2 诊断PNA的特性能够解释它在D

38、NA诊断上的应用.(1) PNA的碱基序列鉴别力和稳定性都好于寡核苷酸.(2) PNA能够以链侵占的方式识别双链DNA.PNA 与互 补核酸的结合极大地改变了电泳迁移率.因此PNA能 够作为诊断 探针用于检测基因突变和错配分析.利用碱基 完全相配的DNA和不 全相配DNA与互 补PNA在结合条件上的不同，通过控制杂交条件，电泳 能够检测 到两者的差异59.该方法适用于 筛选基因突 变样品.Igloi 60将PNA固定于凝胶中，在电泳中PNA会 对互补寡核苷酸 产生阻滞作用，并且能在电泳中进行特 异性杂交.这种方法能实时显示PNA与互补DNA之间 的杂交情况.使用PCR Clamping 方法可

39、以分 析点突 变部位回- 靶核酸PCR扩增是检测基因突变的一个重要 步骤.PNA 与DNA的结合不能被 DNA聚合酶识别，链不能延伸, 扩增不能进行.相反其突变型则可以 很好地扩 增.使用 这一技术可以精确的证实点突 变位置.一种称为 荧光原位杂交(FISH)测定的方法和 PNA 探针技术 结合，已被用于癌症和衰老研究.PNA探针与 DNA探针联合，用于分析X-ray导致的染色体互换62,63, 以及用于 染色体异常诊断64. PNA-FISH 也被用于医学 诊断和环境样品中检测和鉴定细菌65,66,这种检测非常 快速和灵敏，但不能区分存活的和死亡的细菌.2.3 分子生物学工具除了上面提到的一

40、些实验技术，PNA还可用在分子 生物学的许多方面.PNA 可以稳定和 序列特异性地与 dsDNA形成三链的侵占结合，因此PNA能标记质粒 DNA载体67、靶标肽68等.这种标记方法是不可 逆的, 但却是非共价键结合和“生物学沉默”的标记方法.在PCR扩增过程中，加入一端连有荧光信号基团 的特定序列PNA,与DNA靶分子杂交，通过检测扩增 过程中随着温度变化，杂交而改变的 荧光强度，可对 PCR过程进行监测69,70.3 存在的主要问题与进展现在,PNA 已经成为一种非常有用分子生物学工具，但要成为一种基因治疗药物，遇到很多障碍.例如：水溶性差、细胞膜通透性低、PNA/RNA不能激活RNase

41、H、与靶序列结合无方向性等.由于这些原因，许多公司 和研究小组中断了对 PNA的研究.但是仍有许多研究 小组坚持不懈地对PNA进行研究，取得一些进展，部分 地解决了这些问题.由于PNA是电中性化合物 且有自聚集 的趋势，因 此它的水 溶性很差71,并会随着链的增长和嘌呤与嘧 啶比的增高而降低72.在PNA的C端引入赖氨酸71和 在骨架上引入手性极性基团20都能提高PNA的水溶性.73Gildea等 合成化合物16, 17（图16）,连于PNA的N端, 也大大增加了 PNA的水溶性.图17水溶性增强基团结构Figure 17 Structures of solubility enhancers由

42、于受PNA体内转运能力的限制，早期对PNA反 义作用的研究，主要是限于体外无细胞 体系.将PNA与 蛋白等耦联形成嵌合物，能有效的使PNA透过细胞 膜,741转运至细胞、细胞 器或细胞核内.Muratovska 等 将 PNA与亲脂性阳离子基团耦联，可将PNA转运进入细 胞的线粒体中.Eriksson等购将PNA与细胞透过 性多肽 耦联,PNA可以顺利通过Escherichia coli菌的双层膜, 速率与抗菌肽的速率相当.Cutron等761将PNA与核定 位 信号肽和细胞膜转运肽联接，可以PNA转运至细胞核 内.阳离子脂质体包裹是另一种转运PNA的有效方法. 脂质体不适合转运单一的PNA,

43、但可以将PNA和DNA 的杂交物771或嵌合物781转运至细胞内.寡核苷酸的反 义作用是通 过激活RNase H来实现 的，而PNA的反义作用来自于立体阻断.但PNA和 DNA的嵌合物却能激活RNase H79. PNA的存在可提高 生物稳定性和杂交的亲和力 ，而DNA则能提高水溶性 和透膜能力.PNA可以平行3或反平行79的方式与DNA和RNA 杂交，这有可能降 低结合的特异性.最初的研究希望通 过引入手性基团改变 PNA的这一特性211.但结果显示, 手性中心的引入只能略有改善而不完全解决这一问题. 其后，研究人员对骨架带有环状结构的PNA进行了研 究，结合的方向性识别仍只是有所改 善31

44、1.经过十几年的发展，PNA正逐渐走向 成熟.2002年, ISIS公司购买了 PNA的相关专利，准备将其发展为第 三代反义寡核苷酸，这标志着PNA成为药物的 前景已 逐渐被看好.改进PNA的特性，满足PNA成为药物的 需求，仍将是今后PNA的研究重 点.3结论现在，肽核酸能与DNA和RNA特异性结合及化学 和生物学稳定性等特性使其在分子生物学领域得到了 广泛的应用，也带动与之相关的化学、分子生物学和生 物技术领域的发展.但PNA能够成为基因治疗药物，仍 有待于在细胞对PNA的利用效果和安全性评价方面取 得更大的进展.为此，不同结构的PNA单体相继被合成 出来，考察其各种 低聚体和嵌合体的生物

45、学特性，以期 得到具有更好的生物利用度和药代动力学特性的PN代我们期待着 第一种真正的PNA基因治疗药物的岀 现.Refere nces1 Nielson, P. E.; Egholm, M.; Berg, R. H.; Buchardt, O. Sci- ence1991, 254, 1497.2 Buchardt, O.; Egholm, M.; Berg, R. H.; Nielson, P. E. Trends Biotechnol. 1993, 11, 384.3 Egholm, M.; Buchardt, O.; Christensen, L.; Behrens, C.; Frei

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