基因工程的基本操作程序讲稿

1、1一、基因工程的概念：一、基因工程的概念：又叫做又叫做或或。通。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，放到另一种生物的细胞里，地改造生物地改造生物的的。21.限制酶和限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么连接酶的作用分别是什么? 限制酶的作用是能够识别双链限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种分子的某种特特定核苷酸序列定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的之间的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开 DNA连接酶的作

2、用是连接酶的作用是连接连接被限制酶切开的两个核被限制酶切开的两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定5启动子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部

3、位，有了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录的转录6启动子终止子7真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显

4、子： 8一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）11限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库(Genomic library

5、) (Genomic library) 是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基全部基因组因组DNADNA用限制性内切酶或机械用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的力量切割成一定长度范围的DNADNA片段，再与合适的载体在体外重片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文这个群体就称为该生物基因组文库库。其目的是分离有用的目的基。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。因和保存某种生物的全部基因。每个受体菌每个受体菌DNADNA分子都包含一段不同的分子都包含一段不同的外源外源DNADNA片段片段12聚焦

6、二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 cDNAcDNA( (互补互补DNA)DNA)13蛋白质蛋白质mRNADNA推测推测推测推测DNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪合成合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因思考思考: :为什么要

7、构建基因文库为什么要构建基因文库? ?直接从含有目的基因的生物直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗体内提取不行吗? ?15利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因问题问题: :为什么要扩增目的基因为什么要扩增目的基因? ?原理原理:碱基互补配对碱基互补配对原料原料:4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸条件条件: (1)引物引物:人工合成的一段核苷酸系列人工合成的一段核苷酸系列 (2)酶酶:DNA聚合酶聚合酶特点特点:快速快速(指数形式扩增指数形式扩增)过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成

8、_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链185 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /195 5/ /3

9、 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性中温中温延伸延伸5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因211.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体的构建基因

10、表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同23目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因等、标记基因等它们

11、它们各自各自的作的作用是用是什么什么24质粒的构建与改造质粒的构建与改造1)1)删除不必要的删除不必要的DNADNA区域，缩小分子量，提高区域，缩小分子量，提高外源外源DNADNA片段装载量。片段装载量。2)2)灭活某些质粒的编码基因。灭活某些质粒的编码基因。3)3)加入易于识别的选择标记基因。加入易于识别的选择标记基因。 4)4)加入特殊的基因表达调控元件。加入特殊的基因表达调控元件。 一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。载体进

12、行人工改建。 ( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍：）农杆菌介绍：（2 2）

13、原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2728（3）花粉管通道法花粉管通道法29 目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体表达载体与感受态细胞混合与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子31目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测转基因生物的检测转基因生物的染色体染色体DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基

14、因DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究33问题探讨：问题探讨： 将人体的基因转入大肠杆菌中，都能产生相应将人体的基因转入大肠杆菌中，都能产生相应的基因产物吗？（例如要能否通过

15、大肠杆菌生产人的基因产物吗？（例如要能否通过大肠杆菌生产人们所需要的糖蛋白是否可行？）们所需要的糖蛋白是否可行？）1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理

16、由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料5）基因工程是在）基因工程是在DNA分子水平上进行设计分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步