镧系元素和二酮结合于蛋白质标记来检测蛋白质

1、利用铕-二酮类螯合物与蛋白质共价结合的圆偏振发光指纹识别蛋白质用圆偏振发光指纹识别 被-二酮配体标记的金色葡萄球菌核酸酶（SNase）、牛血清蛋白（BSA）、胰岛素（Ins），SNase与BSA和Ins相比表现出反的圆偏振发光特性。利用荧光识别蛋白质表现出的特殊性质来同步选择性识别不同类型的蛋白质，探针分子和蛋白质的结合表现出蛋白质的指纹发射图像轮廓；镧系元素的圆偏振发光（CPL）特性在这个领域应用很广。因为CPL探测能够很好的区分发射的左、右圆偏振发光之间发射光线的不同，并且还可以将几条线区分为不同的级别。CPL（圆偏振发光）正、反（正、负）的信号结合，能很好的将很窄的狭缝分裂开，这种独特的

2、光学特性能够扩大稀土元素化合物探针检测蛋白质的检测范围。因此，我们报道了镧系元素的圆偏振发光指纹识别三种蛋白质，即：被Eu(III)-二酮类化合物共价结合标记的 牛血清蛋白（BSA）、金色葡萄球菌核酸酶（SNase）和牛胰岛素（Ins）。在许多的探针中，-二酮类探针由于它与镧系元素离子之间有高效的能量转移和很高的量子产率而得到发展。由于金色葡萄球菌核酸酶被研发并作为一种典型的蛋白质模型用于折叠或伸展研究149号氨基酸， 其发射比率也可以利用金色葡萄球菌核酸酶的热敏延伸来读出并进行研究。研究蛋白质共价震动的发射图像对生物现象的研究很有帮助，并很有前景。-二酮配体包含有一个丁二酰亚胺酯基团（DK）

3、和一个与蛋白质相互反应的小基团，它能从丁二酰亚胺酯的配体和蛋白质中赖氨酸的残留 氨基得到反应，在蛋白质中产生氨基化合物团体（Scheme 1 first step）。利用质谱仪在蛋白质中检测二酰亚胺酯基团配体，和被标记的DK在蛋白质中产生一个整体的大量转变，这与被标记的DK的数量是一致的。利用丁二酰亚胺酯基团（DK）标记 (vide infra)的金色葡萄球菌核酸酶（SNase）在分子量为17.19 KDa时 产生大量的峰(Fig. 1b)，这与没有标记的SNase(16.80 KDa)相比，蛋白质发生了+0.39 KDa的转变（Fig. 1a）。这种转变来自于SNase中残留的赖氨酸氨基与D

4、K探针的结合即（SNase-DK）。由于每个DK标记的赖氨酸在384 KDa基团上的增加，与没有标记的BSA(Fig. 1c)相比 被标记的BSA产生了+1.5 KDa的转变(Fig. 1d)。在波长为360nm光的激发下，用DK标记的蛋白质表现出很尖锐的发射峰，在EuCl3反应中，Eu3+离子分别发生了5D07F1和5D07F2的电子跃迁(Scheme 1 second step），被DK标记的蛋白质与Eu3+之间的结合常数listed in Table 1，这是由滴定曲线得出的(see ESI, S2)，。为了确认DK标记的蛋白质与Eu3+之间的共价标记，我们对标记的蛋白质进行了凝胶电泳测

5、试；在紫外光照射下BSA-（DK-Eu3+）和SNase-(DK-Eu3+)表现出很强的红色发射 (Fig. 2e, E and F,respectively)。其分子质量分别于获得的质谱数据非常的相近，（17.19 KDa，67.9 KDa）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳很清楚的证明了DK-Eu3+标记的蛋白质移动是由于DK-Eu3+与蛋白质标记后产生了很好的共价结合。胰岛素包含了一个残留的赖氨酸，这个氨基酸同样被DK-Eu3+标记，并产生和SNase,BSA同样的效果。 N-羟基丁二酰亚胺；Scheme 1: SNase被DK-Eu3+标记的原理图；Eu3+空的位置被其他的配体占据（如

6、：溶剂分子水，占据了半圆形的位置）。 Fig 1. 正离子基团的质谱：（a） SNase金色葡萄球菌核酸酶；（b） SNase-DK;（c） BSA牛血清蛋白；（d） BSA-DK;（e） 凝胶电泳分析，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；（A）BSA，（B）SNase,（C）BSA-(DK-Eu3+) 4,Eu3+=24uM,（D）SNase-(DK-Eu3+),Eu3+=3.3uM,;（G）SNase,（H）BSA,（I）SNase 分别在Eu3+为5uM的溶液中；（J）BSA在Eu3+为5uM的离子中；（E）BSA-(DK-Eu3+)4,Eu3+=24uM,（F）SNase-(DK-Eu3

7、+),Eu3+=3.3uM,，E和F分别是在蛋白质浓度为3.0uM浓度下有紫外可见光激发的。Table 1. 结合常数K；发射量子产率， 5D07F1和5D07F2的磁偶极子和电偶极子的非对称因子glum, obs蛋白质和Lys（赖氨酸）被DK-Eu3+标记后的发射寿命；a,取决于在水溶液中经过校准的球状体系；b,圆偏振信号取决于左右圆偏振发射强度的差值（Icpl=IL-IR）;c,是不确定的，因为Lys-Dk似乎形成的是3:1的化合物；d的 glum,值太小而不能精确地计算（断定）；但此值应该是正的；e,没有可探测到的圆偏振光信号；Fig 2.水溶液中各体系的圆偏振光谱；（a）SNase(5

8、.9uM),（b）BSA(1.5uM),（c）Ins(17uM),（d）它们的发射光谱；激发波长为290nm;水溶液体系中的圆偏振光谱；（e）SNase-(DK-Eu3+)，4.8uM，Eu3+=5.3uM；（f）BSA-(DK-Eu3+),1.8uM,Eu3+=80uM;（g）Ins-(DK-Eu3+)，4.6uM，Eu3+=5.1uM；（h）Lys-(DK-Eu3+),18uM,Eu3+=20uM;都是在298K温度下进行的，激发波长为375nm;（i）是它们的发射波普，这些波谱都是典型的5D07F1电子跃迁峰。BSA，0.24uM 的发射峰是黑线，Eu3+，450uM，黑色虚线，激发波长

9、在360nm;插图(e)中的圆二色光谱和(f)水溶液中紫外可见光谱的吸收峰，BSA-（Dk）4，18uM，蓝线，BSA-（Dk-Eu3+）4，18uM，Eu3+=80uM，红线，BSA，0.24uM，黑线，BSA在Eu3+，450uM，黑色虚线。正如预测的，从蛋白质色氨酸中很小的不对称因子gCD(10-4)得到在波长为290nm时的峰带（Fig2.a-c），而没有标记的蛋白质仅有一个很弱的信号，这很弱的信号是有蛋白质中色氨酸和酪氨酸本质的荧光导致的；相比而言，用Dk-Eu3+标记的蛋白质在5D07F1和5D07F2电磁双极子转化跳跃过程中 表现出很强的圆偏振响应（Fig2.e-g）；磁极子在5

10、D07F1的转变能够满足磁极子的选择性规律；当J=0，1（除了00）；这也通常表现出非常强的圆偏振发光。非对称因子（glum）也定义为：IL和IR分别对应的是左右圆偏振光的强度，圆偏振光谱的glum在Table中已经列出，其他的光物理特性如发射寿命（obs），量子产率（）也在Table 1 中列出。SNase-(DK-Eu3+)的不对称因子glum的信号5D07F1和5D07F2转变过程中遵守+，-顺序，而BSA-(DK-Eu3+)的顺序发生逆转变成-，+；正如Table1所示；相比于用DK-Eu3+标记的蛋白质的圆偏振信号强度（Fig.2e-g），用DK-Eu3+标记的赖氨酸（Lys）没有明

11、显的可以探测到的（CPL）圆偏振信号（Fig.2h）。负值是由参考化合物得到的（Fig.2h）,显示出可观察的感应CPL信号源于蛋白质表面的手性原子信号；着在Eu3+中心提供了更多的不对称配位球。在5D07F2 转化峰中，被标记的蛋白质SNase-(DK-Eu3+)、BSA-(DK-Eu3+)4、Ins-(DK-Eu3+)的圆偏振信号显示出 5D07F2转化峰分裂的特征图像，5D07F2转化的的最大分裂有5个级别，（J=-2、-1、0、+1、+2）。BSA-(DK-Eu3+)4表现出一个单独的发射线，在 5D07F2圆偏振信号在J=-2；（Fig.2g）;我们利用Eu3+完成了对未标定的蛋白质

12、进行光谱滴定，在这种条件下，没有检测到变化的峰。Fig.2i,inset Fig.2 e and f；附件中S3和S4。没有标记的凝胶电泳显示，在Eu3+离子存在时，其分子量没有发生变化；（Fig. 1e G-J）;这也不能说明Eu3+离子和蛋白质骨架之间无任何反应的可能性；因此，Eu3+离子和蛋白质之间也可能有很弱的相互反应。相比之下，DK-labeled proteins 在Eu3+存在的情况下由Eu3+的发射能很好的证明其配位成功，因此，观察到的圆偏振信号来源于DK-Eu3+ complex；（Fig .2e and f ）; 在Eu3+存在下的紫外可见光谱和圆二色光谱的变化也支持了DK

13、配位体与Eu3+配位结合的观点；（Insets of Fig.2 e and f ）;SNase 热演变时5D07F1 和 5D07F2 发射强度比率之间的微妙平衡可以通过比率计读出。（vide infra 参照在下）；在Eu3+周围5D07F2 转变对局部的对称性非常的敏感，相比于5D07F1 对配体周围的Eu3+变化不是很敏感。在这种情况下，5D07F2 到5D07F1 之间的发射强度比率应该能和SNase的热诱导去折叠的轮廓相比，而在Eu3+与SNase结合的配位环境中SNase-(DK-Eu3+)的热诱导折叠能发生变化。Fig .3b 表明了SNase-(DK-Eu3+)在5D07F2

14、 到5D07F1之间的发射强度比率(AED/AMD)和温度依据，并且SNase-(DK-Eu3+)的热变性图像可以与圆二色性（CD）相比较表现出；（Fig.3 a）; (AED/AMD)的值从温度在320K开始随着温度的增加而增加；（Fig.3 b）;其图像与圆二色性光谱所测得的非常相似，并且误差由于发射强度比率(AED/AMD)的变化而很小。总之，我们证明了被铕Eu标记的蛋白质有唯一的发射和手性光学特性，被Eu3+和二酮配体标记的蛋白质如SNase,BSA ,Ins的5D07F1 和5D07F2 转变的指纹识别圆偏振发光（CPL）光谱轮廓 ，与BSA-(DKEu3+)4 and Ins-(D

15、KEu3+)相比，SNase-(DKEu3+) 表现出反的圆偏振信号。 这种独特的圆偏振光谱特性和圆偏振光结合能很好的指纹识别目标蛋白质。 总之，5D07F1 和5D07F2 之间的发射强度比率能很好的与SNase的热变性轮廓相一致，这种比率计分析能很好的用来分裂f-f发射宽带峰，并能作为单一的探针来识别蛋白质构象的变化。Fig . S2. 发射光谱的变化可以根据添加EuCl3水溶液来观察到：(a) 被DK配体标记的 金色葡萄球菌核酸酶（1.6uM）;(b) 被DK标记的牛血清蛋白（11uM）；（b） 被DK标记的胰岛素（2.5uM）；都是在298K下进行的。激发波长 290nm; 插图，发射强度的点在613nm,在可见光范围内；Eu3+; 滴定曲线能很好的利用等式 表示，并表现出1:1的比例关系； 系数阿尔法 是在波长 613nm 处的， 初始 光的强度和最