蛋白质组学在非生物胁迫中的研究进展

1、梁冬2014年11月19日蛋白质组学在非生物胁迫中的研究进展蛋白质组学在非生物胁迫中的研究进展 蛋白质组学是继基因组研究之后的又一核心和具有广泛应用价值的学科。蛋白质组学就是对一个基因、一种生物、一种细胞或组织所表达的全部蛋白质的研究。蛋白质组学可以系统地确定细胞或组织内的每一个蛋白质的表达、蛋白质复合体的组成、蛋白质的互作关系和每一个蛋白质的丰度与被修饰的状态等。 由于同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同,即使是同一细胞。在不同的发育阶段、不同的生理条件甚至不同的环境影响下,其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此,蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。 植物在生长发育过程中

2、会受到各种不利的非生物因子的影响,如重金属、高温、盐渍、干旱等。植物感受这些逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达,进而调整自身的生理状态或形态的改变来适应不利环境。n利用蛋白质组学的方法研究植物对这些胁迫的响应,为进一步揭示植物响应胁迫机理提供了新的途径,植物蛋白质组学研究已在许多物种中开展。n对植物发育的不同阶段、不同组织及器官、不同的细胞器以及膜的蛋白质组进行了较为系统的研究。n对胁迫条件下蛋白质组的变化也有较多的研究,对抗逆应答蛋白的鉴定、解析植物抗逆机制具有十分重要的意义。一、非生物胁迫下蛋白质组学研究一、非生物胁迫下蛋白质组学研究 非生物胁迫在自然界普遍存在,它们可

3、以使植物产量严重降低。植物对胁迫作出反应时胁迫诱导基因的蛋白产物会积累以应对不良环境,这些蛋白的功能和表达调控机制是一个重要研究主题。一、非生物胁迫下蛋白质组学研究一、非生物胁迫下蛋白质组学研究1 1、重金属胁迫响应蛋白质组研究、重金属胁迫响应蛋白质组研究 Hajduch等检测了重金属Cu、Cd及Hg对水稻叶片蛋白质组的影响。在被检测的具有可重复结果的33个蛋白中,主要的RuBisCO和防御/胁迫相关蛋白(OsPR5、OsPR10、SOD和放氧蛋白)。最明显的变化是RuBisCO的降解在胁迫条件下增强了。Ahsan等对重金属Cu、Cd胁迫下水稻萌发种子的蛋白质组学进行了研究。经0.5和1.5m

4、M Cu处理4d的水稻萌发种子有18个上调蛋白点(包括乙二醛酶I、peroxiredoxin、醛糖还原酶、DnaK型分子伴侣、UlpI蛋白酶和类受体激酶)和7个下调蛋白点(-淀粉酶和烯醇酶)。研究认为抗氧化剂和胁迫相关蛋白的诱导可能协同作用建立新的稳态以应对Cu胁迫,而一些代谢酶的抑制不仅影响吸水还阻碍贮藏物质分解。在0.2和0.8 mM镉胁迫处理的水稻萌发种子蛋白组研中,发现21个上调蛋白点与Cu胁迫诱导的相似,另有一些蛋白点如球蛋白、ATP合酶和NPR2等。n砷是一种无机有毒物质,在对砷胁迫水稻根系蛋白质组学研究中发现有23个砷调节蛋白,其中S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、GSTs、半

5、胱氨酸合成酶(CS)、GST-tau和酪氨酸特异性蛋白磷酸酶蛋白(TSPP)为砷胁迫上调蛋白。 CS还受H2O2的调节,说明CS的表达被砷或砷诱导的氧化胁迫调节。因GST-omega仅被砷诱导而不被亚硝酸盐、铜或铝诱导,推测它在砷胁迫中起特殊作用。n研究大豆镉胁迫的应答蛋白，Sobkowiak等将悬浮培养的大豆细胞置于不同浓度的镉和35S-标记的蛋氨酸中，并设置三个不同的时间段，然后从细胞中提取蛋白进行SDS-PAGE,CBB染色，新合成的35S-标记的蛋白通过自显影检测分析。挑取蛋白条带进行LC ESI-Q-TOF MS分析后，共鉴定出12个蛋白，其中，8个与抗氧化防御机制有关，一个被鉴定为

6、过氧化物歧化酶Cu-Zn,另外 7个被鉴定为谷胱甘肽-S-转移酶。n过氧化物歧化酶Cu-Zn表达量的提高，表明镉胁迫导致了细胞活性氧的产生。n为研究 Al-耐受植物的防御机制，Zhen等采用经典的 2-DE 以及 MALDI-TOF MS 技术，共鉴定出30个 Al-耐受相关蛋白。n其中，HSPs家族蛋白是在Al 胁迫下新诱导出来的，这表明热激蛋白可能起保护大豆根细胞，防止其降解和变性的作用；n半胱氨酸合成酶也暂时增加，表明其在适应 Al胁迫中也起到了关键的作用。2 2、高温胁迫响应蛋白质组研究、高温胁迫响应蛋白质组研究nLin等研究了高温对水稻颖果发育的影响，在70个差异表达的蛋白中54个用

7、质谱的方法得到鉴定。21个蛋白参与碳水化合物的代谢,14个参与蛋白质的合成与分拣,9个是胁迫响应基因。小分子热激蛋白、3 -磷酸甘油醛脱氢酶及醇溶蛋白被上调,而腊质蛋白、过敏原类蛋白和蛋白延伸因子1被下调。nLee等分析了经42处理12 h和24 h水稻幼苗叶片热激蛋白。1 000个可重复蛋白质点中有73个出现差异表达,结果表明一批低分子量的小热激蛋白被诱导,其中低分子量的线粒体sHSP采用Western blotting进一步验证。在mRNA水平上分析了4个差异积累的与抗氧化酶相关的蛋白点,但蛋白丰度与基因表达并不完全相关。n这些结果说明植物以复杂的方式对热胁迫产生应答,而HSPs在复杂的细

8、胞网络中起到主导作用。nAhsan等应用比较蛋白质组学方法研究大豆幼苗在高温下组织特异性蛋白的表达模式，对暴露于高温中的大豆幼苗的叶、茎和根的蛋白质表达谱的变化进行了分析，在热处理下叶，茎，根分别有54，35和 61 个蛋白点表达差异。差异表达热休克蛋白（HSPs）和抗氧化的蛋白质大部分是上调表达，而与光合作用、次生代谢及氨基酸和蛋白质合成相关的蛋白表达量下调，低分子质量的 HSPs和HSP70在所有组织中上调表达，蛋白质组学分析及免疫印迹分析表明 HSP70、CPN-60和 ChsHSP 的应答具有组织特异性。 这些结果表明，为了应对高温胁迫，大豆幼苗进行了组织特异性的应答调节，组织特异性蛋

9、白质可能在特定组织对应热胁迫应答中起到至关重要的作用。n在小麦的生育期特别是灌浆期时高温将会影响蛋白质的合成及蛋白质组分，进而影响小麦的磨粉和面筋强度等加工品质。Skylas等对两个小麦品种(耐热品种 Fang和不耐热品种 Wyuna)在开花后15d、16d、17d、进行 40和 25 (对照为 24 和18 ）处理开花后 17d和成熟的子粒利用面团品质测验和蛋白质组方法分析热胁迫的效应。n耐热品种 Fang的面团强度在高温处理后增加，而不耐热品种 Wyuna的面团强度在高温处理后降低。n盐胁迫是目前仅次于干旱胁迫增加最快的非生物胁迫因子之一,盐胁迫会引起水分亏缺、离子毒害,导致分子损伤、生长

10、和产量降低,严重限制农业生产。 nRamani和Apte研究了水稻幼苗盐胁迫下多基因的瞬时表达,发现至少有35个蛋白质被盐胁迫诱导和17个蛋白质被抑制,包括20个首次报道的低丰度蛋白。这些发现对寻找渗透胁迫应答新基因,尤其是那些在水稻盐耐性获得中起瞬时调节作用的基因十分重要。3 3、盐胁迫响应蛋白质组研究、盐胁迫响应蛋白质组研究n在对盐胁迫下水稻根蛋白质组的研究中,Yan等发现了54个胁迫响应蛋白质点,其中6个首次被证明属于胁迫响应蛋白质。n推测这些蛋白参与了碳水化合物代谢、能量代谢、氮代谢、硫代谢、氧自由基的清除、细胞骨架的稳定、mRNA的剪接、蛋白质的翻译和定位。nSobhanian 等将

11、大豆种子放在分别含有 0、20、40、80 mmol/L NaCl的沙子中萌发一周。n结果表明 20 mmol/L NaCl对大豆幼苗的生长无显著影响， 80 mmol/L NaCl处理的大豆幼苗死亡， 40 mmol/L NaCl对大豆幼苗的生长有显著影响但不致死。n基于以上结果，提取经40 mmol/L NaCl处理的大豆幼苗的叶子、胚根和根中的蛋白进行蛋白质组分析。 n结果发现叶子、胚根和根中的340、330 和235个蛋白点中分别有19、22、14个蛋白发生表达量变化，且与代谢相关的蛋白主要下调表达，经NaCl处 理 后 的 叶 子 、 胚 根 中 的 甘 油 三 磷 酸 脱 氢酶和胚

12、根、根中的果糖激酶2下调表达，茎中的31ku糖蛋白前体在三个组织中均上调表达。n表明了三个组织中与代谢相关的蛋白在盐胁迫应答中均起到作用。nMajoul等分别以耐盐与不耐盐的小麦品种为材料研究了盐胁迫下根部蛋白的差异表达。nOuerghi等则研究了盐胁迫下小麦叶片可溶性蛋白的差异表达谱变化。nBahrman等研究了两个冬小麦品种在不同的氮素条件下叶片和根部蛋白表达谱的变化。n Vitamvas等报道了冬小麦冷训及回复过程中冷诱导蛋白WCS120蛋白家族的表达谱变化。nSalekdeh等研究了两个3周龄水稻(Oryza sativa.cv CT9993和cv IR62266)干旱胁迫下(23 d

13、不浇水)以及复水(10 d)后的叶片蛋白质,并进行了蛋白质组分析。n结果在电泳胶上得到了1 000多个蛋白质点,发现有42个干旱胁迫响应蛋白质点。恢复正常灌溉10d以后,所有蛋白质的丰度完全或在很大程度上恢复到与未作处理的一样。4 4、干旱胁迫响应蛋白质组研究、干旱胁迫响应蛋白质组研究n用质谱鉴定了16个蛋白,其中变化最大的一个蛋白是S类RNA酶的同源蛋白。n通过蛋白质组学的研究,他们发现了四种新的响应干旱的机制:增加S类RNA酶同源蛋白、肌动蛋白解聚因子、RuBisCO激酶的表达量,降低异黄酮还原酶类蛋白的表达量。n表明叶绿体Cu-Zn SOD在两个水稻品种中显示出截然不同的变化趋势,抗旱品

14、种的上调,不抗旱的减少;而胞浆Cu-Zn SOD在这两个水稻品种中变化趋势相同。nAli和Komatsu4研究了两周龄水稻幼苗在干旱条件下生长26 d后叶鞘蛋白质,其中10个蛋白质丰度升高,2个降低。这些蛋白质分别与植物防御、能量和物质代谢、细胞结构和信号传导有关。n进一步研究表明肌动蛋白解聚因子是干旱胁迫诱导的靶蛋白之一,在这点上与Salekdeh等的研究结果相似。nRiccardi等以无亲缘关系的两系玉米和它们的杂交体为实验材料,对其三星期秧苗进行渐进性干旱处理。n经双向电泳分离检测出的413个蛋白点有78个显示出显著的表达量差异,38种蛋白在不同的基因型的玉米中表达水平也不一样。n报道了

15、6种在其它物种中已有描述但在玉米中首次报导的蛋白质如可溶性无机焦磷酸酶、磷酸核酮糖激酶、叶绿体半胱氨酸合成酶、1,6-二磷酸果糖醛缩酶、ABA诱导蛋白等。n此研究表明干旱胁迫诱导蛋白质表达朝诸如糖酵解、卡尔循环基本细胞代谢途径和更加特异的苯丙素类途径变化。n在众多作物中，大豆对淹水胁迫是高度敏的，水淹会造成大豆产量降低。在过去 20 年，关于大豆在水淹条件下的生理生化反应已经进行了较深入的研究。nShi等研究了淹水胁迫条件下大豆幼苗蛋白质组成的变化，选取萌发 2d的6个大豆栽培品种的幼苗进行3d淹水胁迫处理,提取根部的细胞质和膜蛋白，经双向电泳、银染或考马斯亮蓝染色后，共确定了10 个抗涝蛋白

16、5 5、缺氧胁迫响应蛋白质组研究、缺氧胁迫响应蛋白质组研究n经ESI-Q-TOF MS鉴定出细胞质抗坏血酸过氧化物酶 2 在淹水胁迫下表达量显著下降，与此酶相关的mRNA水平和酶活性也与蛋白水平结果相似。n这表明在淹水胁迫下大豆幼苗根部的细胞质抗坏血酸过氧化物酶 2是高度敏感的。nHashiguchi等分析了大豆种子萌发 48h 后经 6-48h 水淹胁迫后大豆根及胚根蛋白质组的变化。n51 个与能量产生相关的蛋白表达量发生化，特别是鉴定出几个糖酵解酶的上调表达n这些蛋白质的功能分类表明水淹胁迫不仅和含氧量低胁迫有关，还和弱光，疾病和淹水胁迫有关。nAlam等应用蛋白质组技术及生化分析技术研究

17、大豆幼苗营养生长阶段两个时间点上的蛋白质组成及生理生化变化，在早期植物生长阶段的幼苗经 3 和7d 的涝害处理后，大豆根内的脂质过氧化作用及H2O2的水平增加，从大豆根提取的总蛋白经2-DE、MALDI-TOF MS和ESI-MS/MS分析后，24个蛋白点表达差异，其中，14个蛋白上调表达,5个下调表达,5个为涝害胁迫下诱导出的蛋白。n新鉴定出的蛋白涉及到信号转导、细胞程序性死亡、RNA加工、氧化还原平衡和能量代谢。n几个典型的无氧诱导蛋白表达量的增加表明植物在缺氧时通过发酵过程来满足能量的需求，如：糖酵解和发酵过程。n此外，涝害对几个细胞程序化死亡及信号诱导相关蛋白含量的影响，表明他们在胁迫下都起到作用。n以上这些结果表明大豆是通过调节碳代谢和细胞程序化死亡来应对涝害胁迫的。nWilliam W.P. Chang等以玉米秧苗根尖为样品研究了其经过低氧锻炼后缺氧条件下蛋白质的合成情况。n以S35氨酸标记全蛋白质,经双向电