质粒DNA的提取与PCR

1、2 0 12. 1 0一、实验目的：1.学习利用碱变性方法提取细菌中的质粒dna。2.掌握利用琼脂糖凝胶电泳方法检测质粒dna 二、实验原理： 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(dna)分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的dna分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状dna分子(简称cccdna)。相对分子质量一般约为细菌染色体的0.5%-3%, 在1kb-200kb之间。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用

2、的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。 所有分离质粒所有分离质粒dnadna的方法都包括三个基本的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒分离和纯化质粒dnadna。将细菌悬浮液暴露于高。将细菌悬浮液暴露于高phph值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒将质粒dnadna释放到上清液中。碱性溶剂使碱基释放到上清液中。碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒配对完全被破坏，闭环质粒dnadna双链由于处于双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。拓扑缠绕状态而不能彼此分开

3、。 当当phph值恢复到中性时，重新形成完全天然值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体破裂的细胞壁和变性的染色体dnadna会相互缠绕会相互缠绕成大型复合物，与成大型复合物，与pdspds一起沉淀。离心除去变一起沉淀。离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒性剂，从上清液中回收复性的质粒dnadna。 3. 质粒dna的琼脂糖凝胶检测 dna分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, dna分子的迁移速度取决于分子

4、筛效应.具有不同的相对分子质量的dna片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的dna, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的dna分子。 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccdna）存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linear dna）和松弛型(ocdna)。 三三. . 试剂试剂: :溶液50mmol/l葡萄糖25mmol/l triscl(ph8.0)10mmol/ledta(ph8.0)溶液0.2mol/l naoh（临用前用10mol/l贮存液现用现稀释）1%sds溶液5mol/乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml异

5、丙醇 无水乙醇四四. .试验步骤试验步骤: :(1)培养细菌:大肠杆菌接种到lb培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时.(2)取培养液1.5ml于eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液，重复收集一次。加入300ul,充分吹打混匀后,室温放置5分钟.(3)加入300ul新配置的（100ul naoh +100ul sds,用蒸馏水稀释至10ml）,颠倒5-10次,零下20度放置5分钟.(4)加入300ul,颠倒5-10次,放置5分钟.(5)12000rpm离心15分钟,（不大于700ul）于一的eppendorf管.加入等体积异丙醇,混匀后放置5分钟,1200

6、0rpm离心10分钟,.(6)用无水乙醇清洗一次,离心管倒置在吸水纸上2min,自然干燥.(7)加入20ul te 溶液溶解提取物,充分溶解.(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.五、电泳检测试验结果六、结果分析思考题:电泳结果出现几个条带?各是什么?1. 为什么这一方法被称为碱变性法？溶液1,2,3在其中各起到什么作用？实验目的：实验目的：1.学习pcr实验操作与原理2.掌握pcr扩增基因电泳检测方法二. pcr实验原理三三. . 试剂试剂: :1.taq酶：mix2.引物1,23.模版：质粒dna4.灭菌水5.0.2ul eppendorf 管四四. .试验步骤试验步骤: :（一）pcr体系：pcr mix 10ulh2o 9 ul引物1 0.5